本文關(guān)鍵詞：豬GSK3β蛋白對(duì)IL-10、IL-12和GYS1基因表達(dá)的調(diào)控研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：糖原合成酶激酶3(GSK3)是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物中的絲氨酸／蘇氨酸類激酶,其作用的底物高達(dá)100多種,參與眾多的信號(hào)通路并在其中發(fā)揮重要的功能。在哺乳動(dòng)物中GSK3存在GSK3a和GSK3β兩種亞型,它們雖然在結(jié)構(gòu)上具有非常高的同源性,但是其功能卻是不盡相同的。本研究目的在于探究豬GSK3β蛋白及其不同亞型在炎癥反應(yīng)的作用以及對(duì)其直接作用底物糖原合成酶(GS)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究,為進(jìn)一步研究GSK3β基因在豬的抗病育種以及肌肉糖原代謝中的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：(1)用LPS誘導(dǎo)豬腎細(xì)胞系(PK-15),使其產(chǎn)生炎癥反應(yīng),或用GSK3β抑制劑LiCl處理細(xì)胞,利用Western blot檢測(cè)GSK3β的磷酸化程度,進(jìn)而檢測(cè)其活性變化。結(jié)果表明：LPS處理、LiCl處理以及LiCl/LPS共同處理能通過升高PK-15細(xì)胞中的GSK3β (ser9)的磷酸化程度從而降低其GSK3β蛋白的活性；(2)利用ELISA技術(shù)檢測(cè)LPS刺激細(xì)胞以及先用LiCl處理再用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12含量。結(jié)果表明：LPS處理極顯著增加細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12量(P0.01);而使用GSK3β舌性抑制劑即LiCl預(yù)先處理細(xì)胞后再用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞組的IL-10和IL-12表達(dá)量較空白組有顯著的增加(P0.05),但較LPS處理組又有顯著的降低(P0.05),表明GSK3β參與了由LPS誘導(dǎo)的PK-15細(xì)胞對(duì)IL-10和IL-12的分泌；(3)利用qPCR檢測(cè)LPS誘導(dǎo)后GSK3β的5種亞型的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS處理細(xì)胞能引起GSK3β基因5種亞型mRNA表達(dá)水平的變化。其中GSK3β2在15,30,60和120 min呈現(xiàn)顯著地下降(P0.01)；(GSK3β5在30,60和120 mmin呈現(xiàn)顯著地下降(P0.05)；GSK3β3在15,30 min有一個(gè)短暫的顯著上升(P0.05)。這個(gè)結(jié)果說明,GSK3P基因5種亞型可能對(duì)由LPS誘導(dǎo)細(xì)胞的IL-10和IL-12分泌具有不同的調(diào)節(jié)作用；(4)表達(dá)GSK3β的4種亞型后,用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞并用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中的IL-10和IL-12量均出現(xiàn)顯著增加P0.05)。其中GSK3β1的促進(jìn)作用最為強(qiáng)烈,GSK3β3次之,GSK3β2和GSK3β5相對(duì)最弱；(5)利用qPCR檢測(cè)不同時(shí)間的IGF-1處理下的GYSl和GYS2基因的表達(dá)模式。在外源添加物胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)的刺激下,GYSl的mRNA水平表達(dá)出現(xiàn)顯著的上調(diào)變化而GYS2的mRNA水平的表達(dá)量沒有顯著變化；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中過表達(dá)GSK3β后,GYSl的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)極顯著的下降,說明GSK3β影響GYS1的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)；(6)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)構(gòu)建的GYSl的啟動(dòng)子片段活性以及GSK3β共轉(zhuǎn)染GYS1的5個(gè)啟動(dòng)子片段后的其啟動(dòng)子的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)其5個(gè)啟動(dòng)子片段單獨(dú)轉(zhuǎn)染后的相對(duì)熒光值較pGL3-basic有顯著的提高(Pn05),其中片段+224/-350的活性顯著高于+224-/147片段和+224-/539片段(P0.05)；而GSK3β與GYSl的5個(gè)啟動(dòng)子片段共轉(zhuǎn)染后,pGL3-350/+224,pGL3-961/+224, pGL3-1488/+224這三個(gè)片段的啟動(dòng)子相對(duì)熒光值顯著降低(P0.05),說明在GYSl基因的-147至-350,-350到-539以及-539至-961片段之間存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),且這些轉(zhuǎn)錄因子能被GSK3β調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：豬 GSK3β 炎癥反應(yīng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 糖原合成酶 啟動(dòng)子
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 常用符號(hào)縮寫10-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-19
• 1.1 豬糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的研究進(jìn)展13-18
• 1.1.1 GSK3的結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析13-14
• 1.1.2 GSK3β的活性調(diào)節(jié)14
• 1.1.3 GSK3β在信號(hào)通路中的作用14-16
• 1.1.4 GSK3β在炎癥反應(yīng)中的作用16-17
• 1.1.5 GSK3β蛋白對(duì)糖原合成酶的調(diào)控17-18
• 1.2 本研究的目的和意義18-19
• 2 材料與方法19-31
• 2.1 試驗(yàn)材料19-23
• 2.1.1 試驗(yàn)用細(xì)胞系及載體19
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.1.3 主要試劑及試劑盒20-21
• 2.1.4 主要試劑的配制21-23
• 2.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法23-31
• 2.2.1 試驗(yàn)一 豬GSK3β蛋白及其亞型對(duì)細(xì)胞分泌IL-10和IL-12的影響23-28
• 2.2.2 試驗(yàn)二 豬GSK3β對(duì)GYS1基因啟動(dòng)子活性的影響研究28-31
• 3 試驗(yàn)結(jié)果31-39
• 3.1 豬不同GSK3β亞型在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)細(xì)胞下的對(duì)IL-10和IL-12的分泌影響31-35
• 3.1.1 LPS對(duì)豬GSK3β蛋白表達(dá)及磷酸化水平影響分析31-32
• 3.1.2 LiCl對(duì)豬GSK3β蛋白表達(dá)及其磷酸化水平影響分析32
• 3.1.3 LPS刺激下PK-15細(xì)胞的IL-10和IL-12分泌量分析32-33
• 3.1.4 LPS誘導(dǎo)下的GSK3β不同亞型的mRNA表達(dá)水平研究33-34
• 3.1.5 過表達(dá)不同GSK3β亞型對(duì)LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞分泌IL-10和IL-12影響34-35
• 3.2 GSK3β蛋白對(duì)豬GYS1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控35-39
• 3.2.1 豬GYS1和GYS2基因在IGF-1誘導(dǎo)下的mRNA表達(dá)模式35-36
• 3.2.2 過表達(dá)GSK3β對(duì)豬GYS1的mRNA表達(dá)水平影響研究36-37
• 3.2.3 豬GYS1基因的啟動(dòng)子活性分析37-38
• 3.2.4 GSK3β過表達(dá)對(duì)GYS1基因的啟動(dòng)子活性影響分析38-39
• 4 討論39-44
• 4.1 豬GSK3β對(duì)LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞分泌IL-10和IL-12的影響研究39-41
• 4.2 GSK3β對(duì)豬GYS1基因啟動(dòng)子活性的影響研究41-44
• 5 結(jié)論44
• 下一步研究44-46
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 致謝53-54
• 碩士階段發(fā)表論文54

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 張婷婷;馬磊;;蠟樣芽孢桿菌啟動(dòng)子片段克隆及轉(zhuǎn)錄活性分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年04期

2 趙婧婧;王爽;王琦;梅汝鴻;;多粘類芽胞桿菌菌株M-1啟動(dòng)子片段的克隆及綠色熒光蛋白的表達(dá)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2010年04期

3 夏平安;劉維全;崔保安;張紅英;;人胰島素基因在家蠅幼蟲中的表達(dá)[J];河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年04期

4 李勇;王春臺(tái);劉學(xué)群;;煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子片段B的克隆與誘導(dǎo)表達(dá)[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年09期

5 劉文強(qiáng);曹暉;殷吉慶;云彥;華進(jìn)聯(lián);雷安民;;小鼠生殖細(xì)胞特異基因Oct4啟動(dòng)子片段克隆及報(bào)告載體構(gòu)建[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2010年01期

6 李小靖;陳銀華;張俊紅;葉志彪;;番茄SlIAA14基因啟動(dòng)子克隆及分析[J];園藝學(xué)報(bào);2010年10期

7 張爽;武會(huì);杜克久;;幾個(gè)楊樹木質(zhì)部特異啟動(dòng)子片段表達(dá)載體的構(gòu)建與功能分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2012年02期

8 ;[J];;年期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 朱建裕;黃玉屏;沈萍;;極端嗜鹽古生菌RAD25基因啟動(dòng)子片段的克隆及在高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的啟動(dòng)子功能研究[A];湖北省生物工程學(xué)會(huì)2004年年會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告及論文摘要匯編[C];2004年

2 趙淑清;李新鋒;;病程相關(guān)基因啟動(dòng)子片段與GUS的融合基因在擬南芥中的表達(dá)[A];2004年全國(guó)生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 朱亞楠;以脂肪細(xì)胞分泌因子PAI-1為靶點(diǎn)的減肥中藥復(fù)方制劑的初步篩選[D];河南中醫(yī)學(xué)院;2015年

2 王薏琳;豬GSK3β蛋白對(duì)IL-10、IL-12和GYS1基因表達(dá)的調(diào)控研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 吳勇延;小鼠胚胎干細(xì)胞中SUMO修飾對(duì)Nanog調(diào)控作用研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：豬GSK3β蛋白對(duì)IL-10、IL-12和GYS1基因表達(dá)的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：349467