本文關(guān)鍵詞：福州若干野生蕉ISSR分析、離體繁殖及APX克隆與表達(dá)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：香蕉(Musa spp.)是世界四大水果之一,同時(shí)也是重要的糧食作物,具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,但常常遭遇低溫等傷害,造成了不可估量的損失。因此加快培育出抗寒新品種成為了亟需解決的問(wèn)題。而福建省具有豐富的優(yōu)良抗性的野生蕉資源,可以為香蕉育種提供寶貴的種質(zhì)資源和基因資源。因此急需開展對(duì)野生蕉離體繁殖和遺傳背景的研究,進(jìn)一步挖掘和利用野生蕉優(yōu)良的抗性基因,完善香蕉抗寒性研究理論,為培育和改良香蕉新品種提供新的途徑和奠定理論基礎(chǔ)。本研究以福州晉安區(qū)的若干野生蕉為材料,在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上,主要進(jìn)行了日溪野生蕉遺傳多樣性的ISSR分析,宦溪野生蕉離體保存條件的研究,宦溪野生蕉APX家族基因的克隆、定量表達(dá)分析以及轉(zhuǎn)化煙草等研究。主要結(jié)果如下：1福州日溪野生蕉自然群體遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR分析本試驗(yàn)以福州市日溪鄉(xiāng)自然居群的38份野生蕉樣品為材料,采用ISSR分子標(biāo)記并結(jié)合相關(guān)軟件進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。試驗(yàn)結(jié)果表明：篩選的13條引物共擴(kuò)增得到116條DNA條帶,多態(tài)性條帶為70條,多態(tài)性條帶百分率為60.34%,表明福州日溪野生蕉自然群體具有較高水平的遺傳多樣性；結(jié)合NTSYS和STRUCTURE聚類分析將38份野生蕉樣品劃分為6大類,結(jié)合Q值分析表明,福州日溪野生蕉群體內(nèi)部存在著一定的遺傳信息交流。2光質(zhì)對(duì)福州宦溪野生蕉離體繁殖的影響以實(shí)驗(yàn)室繼代保存的宦溪野生蕉組培苗為材料,研究不同光質(zhì)(紅光、藍(lán)光、綠光、紫光、白光、黃光)對(duì)宦溪野生蕉組培苗的離體繁殖的影響。結(jié)果表明：1.白光條件下宦溪野生蕉增殖效果最好,紅光下更有利于野生蕉的離體保存,其他光質(zhì)培養(yǎng)下的組培苗形態(tài)會(huì)產(chǎn)生非正常變化。2.不同光質(zhì)下葉綠素含量的測(cè)定白光處理下葉綠素含量最高。3.不同光質(zhì)條件下測(cè)定的POD酶活性大小依次為：紅光紫光綠光黃光藍(lán)光白光；而CAT酶活性大小則為：白光黃光紫光藍(lán)光綠光紅光。3福州宦溪野生蕉APX家族基因克隆及生物信息學(xué)分析從宦溪野生蕉中分離得到APX家族基因7個(gè)成員的cDNA完整序列。其全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為1031 bp-1473 bp,編碼氨基酸數(shù)目為249-426個(gè)。生物信息學(xué)分析表明：APX家族基因7個(gè)成員均是無(wú)信號(hào)肽的非分泌親水蛋白,APX1-1、APX1-2和APX1-3蛋白穩(wěn)定,其他四個(gè)不穩(wěn)定；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明：APX1-1、APX1-2、APX1-3定位于過(guò)氧化物酶體；APXS-1定位于線粒體基質(zhì)空間；APXT-1定位于線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞質(zhì)膜；APX4-1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；APX4-2定位于細(xì)胞質(zhì)膜；APX家族基因7個(gè)成員均具有KatG,PRK15061的保守結(jié)構(gòu)域,屬于plant_peroxidase_like超家族,其中APX1-2還屬于ApbE superfamily超家族。APX1-2、APX1-3和APXS-1不存在跨膜結(jié)構(gòu),其他成員多具有由內(nèi)向外的跨膜結(jié)構(gòu),磷酸化修飾以絲氨酸為主,蘇氨酸和酪氨酸含量較少。二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、p轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲以及伸展構(gòu)象組成,其中以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主,伸展構(gòu)象次之,β轉(zhuǎn)角所占比例最少。APX家族基因7個(gè)成員均有卷曲螺旋結(jié)構(gòu),三維結(jié)構(gòu)近似球型。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：APX家族7個(gè)基因成員同源性較低,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),預(yù)測(cè)APX家族基因成員的功能不同或具有協(xié)同作用。4福州宦溪野生蕉APX家族基因在不同溫度下定量表達(dá)分析試驗(yàn)對(duì)宦溪野生蕉組培苗在不同溫度下下的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果表明：APX家族基因7個(gè)成員在不同溫度下均有表達(dá)且表達(dá)模式不盡相同。APX1-1、APX1-3和APX4-2表達(dá)量變化呈“倒U型”；APXS-1和APXT-1在13℃處理下表達(dá)量達(dá)到極值,呈現(xiàn)“降-升-降-升”的模式；APX4-1呈現(xiàn)“先降后升”的模式；APX1-2則呈現(xiàn)“U型”表達(dá)模式,在28℃和0℃下均大量表達(dá)。5.福州宦溪野生蕉MuAPX1-2轉(zhuǎn)化煙草研究本試驗(yàn)采用酶切連接法成功構(gòu)建了MuAPX1-2基因的正義和反義-pCAMBIA 1301-(±)-Mu-APX1-2表達(dá)載體,成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和GUS檢測(cè),最終獲得正義轉(zhuǎn)化煙草17株,反義轉(zhuǎn)化煙草20株,轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性率為69.81%。目前已經(jīng)獲得了正義和反義TO代轉(zhuǎn)基因煙草種子。
【關(guān)鍵詞】：野生蕉 ISSR分子標(biāo)記 離體繁殖 APX基因家族 表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S668.1
【目錄】：

• 縮寫詞8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 第一章 引言15-25
• 1 ISSR分子標(biāo)記在芭蕉屬植物的研究進(jìn)展16-17
• 2 芭蕉屬植物離體繁殖研究進(jìn)展17-18
• 3 植物抗寒基因研究進(jìn)展18-21
• 3.1 膜穩(wěn)定相關(guān)基因18-19
• 3.2 抗氧化活性基因19
• 3.3 抗凍蛋白基因19-20
• 3.4 低溫信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子20
• 3.5 滲透調(diào)節(jié)基因20-21
• 4 芭蕉屬植物抗寒分子生物學(xué)研究進(jìn)展21-22
• 5 APX家族基因的研究進(jìn)展22-23
• 6 本研究的意義和主要研究?jī)?nèi)容23-25
• 6.1 本研究的意義23-24
• 6.2 本研究的主要研究?jī)?nèi)容24-25
• 第二章 福州日溪野生蕉自然群體ISSR分析25-34
• 1 材料與方法25-26
• 1.1 材料25
• 1.2 方法25-26
• 2 結(jié)果與分析26-32
• 2.1 日溪野生蕉DNA提取與ISSR-PCR擴(kuò)增26-27
• 2.2 日溪野生蕉自然居群的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析27-31
• 2.3 日溪野生蕉自然居群的遺傳多樣性分析31-32
• 3 討論32-34
• 3.1 福州市日溪野生蕉遺傳多樣性程度相對(duì)較高32
• 3.2 兩種聚類分析方法結(jié)合有助于提高野生蕉樣本聚類分析的準(zhǔn)確性32-34
• 第三章 不同光質(zhì)對(duì)福建野生蕉的增殖影響34-48
• 1 材料與方法34-35
• 1.1 材料34
• 1.2 方法34-35
• 2 結(jié)果和分析35-45
• 2.1 不同光質(zhì)對(duì)宦溪野生蕉組培苗離體繁殖的影響35-44
• 2.2 不同光質(zhì)下宦溪野生蕉組培苗離體保存中葉綠素含量的比較44
• 2.3 不同光質(zhì)下宦溪野生蕉組培苗離體保存中過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的比較44-45
• 3 討論45-48
• 3.1 光質(zhì)對(duì)宦溪野生蕉離體繁殖的影響45-46
• 3.2 野生蕉組培苗葉綠素含量與成分在不同光質(zhì)下的變化46-47
• 3.3 光質(zhì)影響野生蕉組培苗POD和CAT酶活性的變化47-48
• 第四章 福建野生蕉APX家族7個(gè)成員的克隆48-62
• 1 材料與方法48-50
• 1.1 材料48
• 1.2 方法48-50
• 2 結(jié)果與分析50-60
• 2.1 宦溪野生蕉總RNA的提取及其質(zhì)量檢測(cè)50-51
• 2.2 APX家族基因7個(gè)成員的克隆51-56
• 2.3 宦溪野生蕉與馬來(lái)西亞小果野蕉APX家族7個(gè)成員基因ORF序列比對(duì)結(jié)果56-59
• 2.4 APX家族基因7個(gè)成員序列分析59-60
• 3 討論60-62
• 3.1 APX家族基因成功克隆的研究意義60-61
• 3.2 宦溪野生蕉與馬來(lái)西亞小果野蕉APX家族基因差異性的探討61-62
• 第五章 福建野生蕉APX家族7個(gè)成員的生物信息學(xué)分析62-77
• 1 材料與方法62
• 1.1 材料62
• 1.2 方法62
• 2 結(jié)果分析62-75
• 2.1 宦溪野生蕉APX家族7個(gè)基因蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)與分析62-63
• 2.2 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員蛋白質(zhì)信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)與分析63-64
• 2.3 宦溪野生家族基因7個(gè)成員蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)n,與分析64-66
• 2.4 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析66-67
• 2.5 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)與分析67-68
• 2.6 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析68-70
• 2.7 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析70
• 2.8 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析70-72
• 2.9 宦溪野生蕉APX家族基因7個(gè)成員系統(tǒng)進(jìn)化樹72
• 2.10 宦溪野生蕉APX家族基因cDNA序列分析72-73
• 2.11 宦溪野生蕉APX家族基因3'UTR與5'UTR多序列比對(duì)分析73-75
• 3 討論75-77
• 3.1 宦溪野生蕉擁有結(jié)構(gòu)與功能多樣性的APX家族蛋白75-76
• 3.2 宦溪野生蕉APX家族可變剪接現(xiàn)象分析76-77
• 第六章 宦溪野生蕉APX家族基因定量表達(dá)分析77-84
• 1 材料與方法77-78
• 1.1 材料77
• 1.2 試劑及儀器77
• 1.3 方法77-78
• 2 結(jié)果與分析78-82
• 2.1 宦溪野生蕉不同溫度處理下組培苗葉片總RNA的提取及質(zhì)量分析79
• 2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增參照基因和APX家族基因參數(shù)分析79
• 2.3 宦溪野生蕉葉片不同溫度處理下APX基因相對(duì)定量表達(dá)分析79-82
• 3 討論82-84
• 3.1 APX家族基因不同成員對(duì)溫度信號(hào)特異響應(yīng)表達(dá)82-83
• 3.2 APX家族基因不同成員間協(xié)同互補(bǔ)共同抵抗逆境脅迫83-84
• 第七章 宦溪野生蕉MuAPX1-2遺傳轉(zhuǎn)化煙草研究84-90
• 1 材料與方法84-87
• 1.1 材料84-85
• 1.2 方法85-87
• 2 結(jié)果與分析87-89
• 2.1 宦溪野生蕉正義和反義載體構(gòu)建及重組質(zhì)粒的鑒定87
• 2.2 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)87-89
• 3 討論89-90
• 第八章 小結(jié)與展望90-92
• 參考文獻(xiàn)92-102
• 附錄Ⅰ 福州日溪鄉(xiāng)自然居群38份樣本ISSR-PCR凝膠電泳圖譜102-109
• 附錄Ⅱ 宦溪野生蕉不同光質(zhì)下生長(zhǎng)狀況109-114
• 附錄Ⅲ 宦溪野生蕉APX家族基因cDNA序列信息114-118
• 附錄IV APX1-2基因轉(zhuǎn)化煙草研究118-120
• 在學(xué)期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況120-121
• 致謝121

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