本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及ELISA檢測(cè)方法的初步建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea viruse,PEDV)引起的一種急性腸道疾病,以嘔吐、水樣腹瀉為主要特征,嚴(yán)重時(shí)可引起病豬死亡。1978年,該病首次在英國(guó)和比利時(shí)被報(bào)道,此后歐洲、亞洲的多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了PED的發(fā)生與流行。近幾年,一種變異的PEDV在我國(guó)豬群中開(kāi)始流行,并引起七日齡以?xún)?nèi)新生仔豬嚴(yán)重腹瀉和高死亡率,本研究從腹瀉仔豬的腸道組織成功分離到一株P(guān)EDV流行毒株,測(cè)定了其全基因組序列,并初步建立了檢測(cè)PEDV抗體的間接ELISA方法和基于單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法。具體研究?jī)?nèi)容如下:1、PEDV的分離鑒定與全基因組分析本試驗(yàn)通過(guò)嘗試多種細(xì)胞、培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)條件,成功分離出一株豬流行性腹瀉病毒。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、全基因組克隆、同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析等證實(shí)該分離株是目前廣泛流行的變異PEDV,暫時(shí)命名為SH6株,屬于Group II。全序列分析證明該病毒的基因組大小為28,038 bp,從5’端至3’端,編碼蛋白依次是多聚蛋白(6,781 aa),S蛋白(1,386 aa),ORF3蛋白(224 aa),E蛋白(76 aa),M蛋白(226 aa)和N蛋白(441 aa)。2、PEDV N蛋白的原核表達(dá)和間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立為建立豬流行性腹瀉病毒N蛋白間接ELISA檢測(cè)方法,本研究從新分離PEDV流行毒株(JS-2013)中擴(kuò)增其N(xiāo)基因,并將N基因克隆至p Cold-I DNA原核表達(dá)載體中,構(gòu)建p Cold-I-N重組質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白呈可溶性表達(dá)。將純化的N蛋白作為包被抗原建立PEDV間接ELISA檢測(cè)方法,并且對(duì)各種檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后確定N蛋白最佳包被條件為37℃包被2 h,最佳抗原包被量為200 ng/孔,最佳封閉條件為5%脫脂乳37℃封閉2 h,最佳血清稀釋度為1:200,血清最佳孵育時(shí)間為37℃孵育20 min,二抗最適稀釋度為1:2×104,二抗最佳孵育時(shí)間為40 min,臨界值為0.345~0.394,介于兩者之間為可疑。并對(duì)50份已知背景血清進(jìn)行檢測(cè),符合率達(dá)94%。該間接ELISA方法為PEDV診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了依據(jù)。3、抗N蛋白單克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法的初步建立將純化的重組N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,運(yùn)用雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)最終獲得1株穩(wěn)定分泌抗PEDV N蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為:2B8。擴(kuò)大培養(yǎng)該雜交瘤細(xì)胞株接種BALB/c小鼠,制備腹水。經(jīng)鑒定,腹水效價(jià)在105以上。Western blot和IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示該單克隆抗體具有良好的反應(yīng)性和特異性。與其他豬源病毒無(wú)交叉反應(yīng)。將獲得的單克隆抗體作為競(jìng)爭(zhēng)一抗初步建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。并對(duì)工作條件進(jìn)行優(yōu)化,確認(rèn)最佳工作條件和陰陽(yáng)性判定臨界值。其中陰性血清臨界值=X+2SD=33.2%,陽(yáng)性血清臨界值=X+3SD=38.6%,介于兩者之間為可疑。本試驗(yàn)初步建立的兩種檢測(cè)PEDV抗體的ELISA方法,為PEDV變異株感染的診斷及其流行病學(xué)分析奠定了重要的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 分離與鑒定 N蛋白 ELISA 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 附件3-6
• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-20
• 1.1 PEDV的分類(lèi)地位13
• 1.2 PEDV的形態(tài)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)13
• 1.3 PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)特性13-14
• 1.4 PEDV的基因組結(jié)構(gòu)與功能14-15
• 1.5 PEDV的主要基因組結(jié)構(gòu)與功能15-16
• 1.5.1 主要結(jié)構(gòu)基因及其功能15
• 1.5.2 非結(jié)構(gòu)基因及其功能15-16
• 1.6 PEDV的主要蛋白結(jié)構(gòu)與功能16-17
• 1.6.1 結(jié)構(gòu)蛋白及其功能16-17
• 1.6.2 非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能17
• 1.7 PEDV的診斷技術(shù)17-18
• 1.7.1 臨床診斷及病理組織變化17
• 1.7.2 實(shí)驗(yàn)室診斷方法17-18
• 1.8 免疫預(yù)防18-19
• 1.8.1 PED滅活苗19
• 1.8.2 PEDV弱毒疫苗19
• 1.9 研究目的和意義19-20
• 第二章 豬流行性腹瀉病毒的分離、鑒定及全基因組分析20-37
• 2.1 主要材料20-21
• 2.1.1 載體、菌株和試劑盒20
• 2.1.2 主要試劑及配制20-21
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備21
• 2.1.4 分子生物學(xué)軟件21
• 2.1.5 樣品采集21
• 2.2 方法21-26
• 2.2.1 糞樣的處理21
• 2.2.2 變異PEDV的分離及鑒定21
• 2.2.3 免疫熒光（IFA）檢測(cè)變異PEDV21-22
• 2.2.4 病毒蝕斑純化22
• 2.2.5 引物設(shè)計(jì)22-23
• 2.2.6 RNA的提取23-24
• 2.2.7 反轉(zhuǎn)錄和雙鏈cDNA合成24
• 2.2.8 PCR擴(kuò)增24-25
• 2.2.9 3’RACE和 5’RACE25
• 2.2.10 PCR產(chǎn)物的純化25-26
• 2.2.11 PCR產(chǎn)物的測(cè)序26
• 2.2.12 變異PEDV的序列分析26
• 2.3 結(jié)果26-35
• 2.3.1 PEDV的分離及鑒定26-27
• 2.3.2 PEDV的全基因組克隆和序列分析27-35
• 2.4 討論35-37
• 第三章 PEDV N蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立37-48
• 3.1 材料與方法37-41
• 3.1.1 主要材料與試劑37
• 3.1.2 PEDV重組N蛋白的原核表達(dá)與純化37-39
• 3.1.3 間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立39-40
• 3.1.4 間接ELISA檢測(cè)方法臨界值的確立40
• 3.1.5 符合率分析40
• 3.1.6 重復(fù)性測(cè)試40-41
• 3.2 結(jié)果41-47
• 3.2.1 PEDV重組N蛋白的原核表達(dá)及純化41-43
• 3.2.2 間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化結(jié)果43-45
• 3.2.3 間接ELISA臨界值的確立45-46
• 3.2.4 間接ELISA符合率試驗(yàn)結(jié)果46
• 3.2.5 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果46-47
• 3.3 討論47-48
• 第四章 抗N蛋白單克隆抗體的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的初步建立48-63
• 4.1 材料與方法48-54
• 4.1.1 主要材料與試劑48
• 4.1.2 包被抗原的制備48
• 4.1.3 抗N蛋白單克隆抗體的制備48-52
• 4.1.4 抗N蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用52-53
• 4.1.5 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的初步建立53-54
• 4.1.6 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法臨界值的確定54
• 4.1.7 符合率分析54
• 4.1.8 重復(fù)性測(cè)試54
• 4.2 結(jié)果54-61
• 4.2.1 包被抗原的制備54
• 4.2.2 抗N蛋白單克隆抗體的制備54-56
• 4.2.3 抗N蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用56-57
• 4.2.4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立及條件優(yōu)化結(jié)果57-60
• 4.2.5 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法臨界值的確定60
• 4.2.6 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法符合率試驗(yàn)結(jié)果60
• 4.2.7 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果60-61
• 4.3 討論61-63
• 第五章 全文結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-72
• 作者簡(jiǎn)歷72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

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6 還紅華,何孔旺,倪艷秀,林繼煌,華國(guó)浩,梁曉輝;豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的田間免疫試驗(yàn)[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;2002年06期

  本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及ELISA檢測(cè)方法的初步建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：348289