發(fā)布時(shí)間：2017-05-02 13:08

  本文關(guān)鍵詞：3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是菊酯類(lèi)農(nóng)藥生物降解途徑中的第一個(gè)代謝產(chǎn)物。3-PBA的半衰期較菊酯類(lèi)農(nóng)藥更長(zhǎng)(180d),生物毒性更大,研究證實(shí)3-PBA具有抗雌激素的特性,可紊亂生物體內(nèi)分泌代謝。因此開(kāi)展3-PBA的生物降解研究,克隆降解基因,對(duì)保障生態(tài)安全有重要意義。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的菊酯農(nóng)藥降解菌株4-D為出發(fā)材料,構(gòu)建4-D菌基因組文庫(kù),以3-PBA為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽平板為篩選平板,通過(guò)混合池馴化篩選獲得可以3-PBA作唯一碳源的重組菌4D-3-4,通過(guò)測(cè)序比對(duì)并分析插入片段,經(jīng)ORF分析得到921 bp的完整閱讀框,該核苷酸序列命名為D34(Genebank登錄號(hào)為KR024742),經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)和生物軟件分析,其應(yīng)為鄰苯二酚雙加氧酶,是4-D菌降解3-PBA過(guò)程中起主要作用的基因。運(yùn)用Swiss-Model對(duì)該基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行了氨基酸結(jié)構(gòu)分析和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。氨基酸序列長(zhǎng)度為306 aa,Aligned蛋白數(shù)量為47,PDB結(jié)合結(jié)構(gòu)數(shù)量為13,該蛋白不含二硫鍵,具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,酶活位點(diǎn)位于第一結(jié)構(gòu)域,第二結(jié)構(gòu)域與蛋白折疊和跨膜相關(guān),其正確折疊需要Ca 2+參與。根據(jù)D34完整閱讀框序列設(shè)計(jì)引物,并在引物兩端分別加上Nde I和HindⅢ識(shí)別位點(diǎn),以原始菌株基因組DNA為模版,成功克隆到921bp的D34基因序列。以pET-21b為載體,BL21(DE3)為宿主菌,構(gòu)建了D34基因的非融合原核表達(dá)載體,并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)重組表達(dá)菌株進(jìn)行了3-PBA的降解性能研究,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS-PAGE驗(yàn)證分析和酶部分理化性質(zhì)分析。IPTG誘導(dǎo)后可見(jiàn)46kDa大小的蛋白特異表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有鄰苯二酚特征反應(yīng)活性,降解最適條件為pH 7.0,溫度30oC,與4-D菌最適生長(zhǎng)條件一致。
【關(guān)鍵詞】：3-PBA 基因組文庫(kù) 3-PBA-降解基因 鄰苯二酚雙加氧酶 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S481;Q78
【目錄】：

• 附件3-6
• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-22
• 1.1 3-PBA研究進(jìn)展13-15
• 1.1.1 3-苯氧基苯甲酸概況13
• 1.1.2 3-苯氧基苯甲酸相關(guān)的微生物代謝研究13-14
• 1.1.3 微生物降解 3-苯氧基苯甲酸的途徑14-15
• 1.2 常規(guī)檢測(cè) 3-PBA方法15-16
• 1.2.1 HPLC法測(cè)定土壤中 3-PBA濃度15-16
• 1.2.2 氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)尿液中 3-PBA殘留濃度16
• 1.2.3 HPLC法測(cè)定微生物培養(yǎng)體系中 3-PBA16
• 1.2.4 結(jié)合分散液-液微萃取和注射.硅烷基化及MIP的新方法16
• 1.3 基因組文庫(kù)技術(shù)應(yīng)用16-18
• 1.3.1 基因組文庫(kù)簡(jiǎn)介16-18
• 1.3.2 基因組文庫(kù)應(yīng)用18
• 1.4 原核表達(dá)研究概況18-19
• 1.5 本研究背景、意義與技術(shù)路線(xiàn)19-22
• 1.5.1 研究背景、意義與創(chuàng)新點(diǎn)19-21
• 1.5.2 技術(shù)路線(xiàn)圖21-22
• 第二章 HPLC法檢測(cè)不動(dòng)桿菌對(duì) 3-PBA降解能力22-27
• 2.1 材料與試劑22-23
• 2.1.1 材料22
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器22
• 2.1.3 化學(xué)試劑22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 2.2.1 4-D菌的活化與降解馴化23
• 2.2.2 HPLC檢測(cè) 4-D降解體系中的 3-PBA濃度23
• 2.2.3 3-苯氧基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制23
• 2.2.4 繪制3-PBA降解曲線(xiàn)23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析24-25
• 2.3.1 3-PBA檢測(cè)方法確定24
• 2.3.2 3-PBA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)24-25
• 2.3.3 4-D菌、大腸桿菌JM109及轉(zhuǎn)化載體pUC19的JM109對(duì) 3-PBA的降解情況25
• 2.4 討論25-27
• 第三章 構(gòu)建不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）基因組文庫(kù)27-33
• 3.1 材料與試劑27-28
• 3.1.1 材料27
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器27
• 3.1.3 化學(xué)試劑27-28
• 3.2 試驗(yàn)方法28-30
• 3.2.1 基因組DNA提取28
• 3.2.2 質(zhì)粒DNA提取28
• 3.2.3 基因組DNA部分酶切體系28-29
• 3.2.4 載體DNA完全酶切體系及 5’磷酸基團(tuán)去磷酸化處理29
• 3.2.5 連接體系29
• 3.2.6 感受態(tài)細(xì)胞制備29-30
• 3.2.7 轉(zhuǎn)化30
• 3.2.8 基因組文庫(kù)驗(yàn)證30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-31
• 3.3.1 基因組DNA與質(zhì)粒DNA提取和酶切驗(yàn)證30-31
• 3.3.2 目的片段與載體的連接轉(zhuǎn)化及文庫(kù)隨機(jī)驗(yàn)證31
• 3.4 討論31-33
• 第四章 文庫(kù)池篩獲得 3-PBA降解重組子33-41
• 4.1 材料與試劑33
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料33
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器33
• 4.1.3 試劑33
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法33-34
• 4.2.1 陽(yáng)性克隆篩選33-34
• 4.2.2 混合池構(gòu)建及馴化篩選34
• 4.2.3 序列驗(yàn)證、測(cè)序與ORF分析34
• 4.2.4 氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析34
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-40
• 4.3.1 陽(yáng)性重組載體驗(yàn)證34-35
• 4.3.2 ORF比對(duì)35-36
• 4.3.3 921 bp ORF序列信息36-37
• 4.3.4 Blast比對(duì)結(jié)果37
• 4.3.5 氨基酸序列分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)37-40
• 4.4 實(shí)驗(yàn)討論40-41
• 第五章 3-PBA降解關(guān)鍵基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建41-52
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 5.1.1 菌株與質(zhì)粒41
• 5.1.2 主要儀器41
• 5.1.3 主要試劑41-42
• 5.1.4 主要試劑配制42
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法42-46
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)42-43
• 5.2.2 pET-21b-D34表達(dá)載體的構(gòu)建43-45
• 5.2.3 重組表達(dá)載體工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)45-46
• 5.2.4 重組表達(dá)載體工程菌的降解驗(yàn)證46
• 5.3 結(jié)果與分析46-51
• 5.3.1 目的基因的獲得46
• 5.3.2 D34與T載體的連接轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性重組雙酶切驗(yàn)證46-48
• 5.3.3 D34與pET-21b載體的連接與重組載體驗(yàn)證48-49
• 5.3.4 SDS-PAGE分析工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)49-50
• 5.3.5 芳香族底物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)50
• 5.3.6 重組表達(dá)菌降解驗(yàn)證50-51
• 5.3.7 降解酶最適條件優(yōu)化51
• 5.4 討論51-52
• 第六章 全文結(jié)論與展望52-53
• 6.1 全文結(jié)論52
• 6.2 展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 附錄59-64
• 致謝64-65
• 作者簡(jiǎn)歷65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 虞云龍,陳鶴鑫,樊德方,盛國(guó)英,傅家謨;擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的酶促降解[J];環(huán)境科學(xué);1998年03期

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3 ;Immunization of Male Mice with a New Recombinant GnRH Fusion Protein Reduces the Testicular Function[J];Agricultural Sciences in China;2009年03期

4 余慧群;廖艷芳;周海;莫友彬;黃科林;林衛(wèi)江;慕朝師;;擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑研究進(jìn)展[J];企業(yè)科技與發(fā)展;2010年20期

  本文關(guān)鍵詞：3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆與表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：340997