光溫敏核不育系水稻PA64S的育性轉(zhuǎn)換與日照長(zhǎng)短和溫度高低有密切關(guān)系,一般表現(xiàn)為長(zhǎng)日、高溫條件下不育,短日、低溫條件下可育。光敏不育基因pms3等的鑒定揭示了PA64S等光溫敏不育系水稻受光周期的影響調(diào)控花粉育性的分子機(jī)制,但是溫度如何參與PA64S育性調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制尚不明確。本研究擬探討PA64S孕穗期高、低溫條件下miRNA的表達(dá)譜差異,篩選PA64S與溫敏育性關(guān)聯(lián)的miRNAs及其靶基因,為進(jìn)一步解析PA64S溫敏育性調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。對(duì)PA64S水稻單核期早期花藥分別經(jīng)過30℃（雄性不育）和22℃（雄性可育）處理,構(gòu)建兩個(gè)cDNA文庫(kù)（PA64S-H、PA64S-L）,并進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序,對(duì)PA64S不同溫度下的mi RNA表達(dá)譜進(jìn)行了初步的研究,主要結(jié)果如下:1、本研究經(jīng)不育高溫（30℃）和可育低溫（22℃）處理兩周的孕穗期PA64S水稻花藥為材料,Trizol法提取其RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的樣品28S RNA和18SrRNA條帶清晰,說明樣品RNA降解較少,OD260/OD280比值在1.8-2.2之間說明RNA純度較高,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。提取的合格R... 

【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

miRNA作用機(jī)制（引自李海明等，2006）[34]

高低溫下不育系水稻PA64S花藥的miRNA表達(dá)譜13技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Rfam(11.0)(RNA家族數(shù)據(jù)庫(kù))的搜索，識(shí)別為tRNA、rRNA、snRNA和snoRNA的獨(dú)特序列。該序列與miRBase中物種的miRNA序列配對(duì)(http://mirbase.org/)，以獲得樣本中已經(jīng)存在的已知miRNA以及其堿基分布。為了識(shí)別PA64S-H和PA64S-L表達(dá)差異的miRNA，我們首先對(duì)每百萬份轉(zhuǎn)錄本中miRNA的表達(dá)進(jìn)行了量化。計(jì)算P值和褶皺變化，確定表達(dá)差異的顯著性。差異表達(dá)miRNA的標(biāo)準(zhǔn)缺失為|fold-change|>2,P值<0.5。已知miRNA的序列存在miRNA和新的miRNA被用來Patmatch軟件預(yù)測(cè)潛在的靶基因。獲得單個(gè)樣本表達(dá)的miRNA靶基因后，我們對(duì)該基因部分進(jìn)行GO(GeneOntology)功能分析和KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenome)通路分析。此外，我們對(duì)已知的miRNA和新的miRNA進(jìn)行靶基因富集分析。圖2-1：小RNA信息分析流程（https://www.docin.com/p-2177213616.html）2.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)差異miRNA以方法2.2.2中的cDNA文庫(kù)為材料，實(shí)時(shí)熒光定量PCR來檢測(cè)兩個(gè)文庫(kù)差異miRNA的表達(dá)水平，利用Primers軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)的特異性引物，實(shí)驗(yàn)中所用的引物均由上海生工公司合成，實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）在室溫融化2xmiRNAqPCRMix和Reverseprimer（10μM）。

高低溫下不育系水稻PA64S花藥的miRNA表達(dá)譜153結(jié)果與分析3.1PA64S水稻miRNA文庫(kù)樣品總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)兩系雜交稻溫敏不育系PA64S培養(yǎng)至始穗期，經(jīng)22℃（低于不育起始溫度23.3℃，花粉可育）處理兩周，取可育的單核小孢子期的花藥樣品，標(biāo)為PA64S-L由。經(jīng)30℃（不育溫度）處理兩周的不育花藥材料做對(duì)照（PA64S-H）。由于高通量測(cè)序?qū)NA樣品的質(zhì)量要求較高，因此對(duì)所分離的樣品總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18SrRNA條帶清晰，說明RNA降解較少（圖3-1）。再經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。RNA樣品的濃度在412-613ng/uL之間，OD260/OD280比值在1.8-2.2之間，OD260/OD230比值大于1.8,28S/18S比值在1.5-2.2之間，符合高通量測(cè)序樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用于下一步的測(cè)序?qū)嶒?yàn)。圖3-1：PA64S-H和PA64S-L樣品總RNA瓊脂糖電泳3.2.PA64S-H和PA64S-L樣品測(cè)序結(jié)果初步分析3.2.1PA64S-H和PA64S-LmiRNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及可讀有效序列篩選為探討PA64S水稻對(duì)溫度敏感的單核期早期的不育與可育花藥之間差異表達(dá)的miRNA，我們用經(jīng)30℃和22℃處理的單核期PA64S水稻花藥為材料，分

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]miRNA在水稻產(chǎn)量和脅迫方面的研究進(jìn)展[J]. 杜思宇,郭國(guó)強(qiáng),洪艷云.  雜交水稻. 2019(06)
[2]淺析水稻雜交育種方法及展望[J]. 李婷婷.  新農(nóng)業(yè). 2019(21)
[3]光溫敏雄性不育水稻的研究進(jìn)展[J]. 范優(yōu)榮,曹曉風(fēng),張啟發(fā).  科學(xué)通報(bào). 2016(35)
[4]水稻光溫敏核不育系生育期的模擬及預(yù)測(cè)[J]. 徐建飛,王華,尚博.  農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2015(15)
[5]植物miRNA的研究方法概述[J]. 易小婭,楊瑞瑞,曾幼玲.  植物生理學(xué)報(bào). 2015(04)
[6]Small RNAs in pollen[J]. HE Hui,YANG TianYu,WU WenYe,ZHENG BingLian.  Science China Life Sciences. 2015(03)
[7]雜交水稻育種將迎來新時(shí)代[J]. 鄧興旺,王海洋,唐曉艷,周君莉,陳浩東,何光明,陳良碧,許智宏.  中國(guó)科學(xué):生命科學(xué). 2013(10)
[8]‘培矮64S’在長(zhǎng)沙、�？�、南昌三地的育性差異分析[J]. 寧金花,張艷貴,宋忠華.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2013(09)
[9]miRNA——一種新的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA[J]. 李海明,施南峰.  中國(guó)癌癥雜志. 2006(08)
[10]水稻光溫敏核不育系的光溫特性及其熟期性模型研究[J]. 周玉,徐立新,袁潛華,羅越華,姚克敏.  雜交水稻. 2005(04)



本文編號(hào)：3366065