本文關鍵詞：幾種海洋經濟動物種質資源超低溫冷凍保存研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：種質資源是海水養(yǎng)殖生產、優(yōu)良品種培育及海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質基礎。然而,隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,海洋動物核心種質鑒定和保護研究嚴重滯后的負面效應日益突出。超低溫保存技術是種質細胞長期保存的重要方法,相關理論與技術的發(fā)展,對于種質資源的保護、遺傳改良以及養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著重要應用價值和理論意義。1.太平洋鱈精液超低溫冷凍采用分步降溫法冷凍保存太平洋鱈(Gadus macrocephalus)精液,并用掃描電鏡和透射電鏡技術研究了精子的超微結構損傷。分析了添加劑(蛋黃)及五種抗凍劑(PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇))不同濃度(8%、10%、12%、14%、16%、18%)對太平洋鱈精子冷凍保存效果的影響。實驗結果表明,蛋黃能夠顯著提高太平洋鱈冷凍保存效果(P0.05)；在以HBSS為稀釋液,12%PG中添加10%蛋黃保存的凍融精子運動率最高(85.87%±1.6%),顯著高于其他凍存組(P0.05)。添加蛋黃的12%濃度的DMSO組解凍后精子運動速率較高,平均直線速度、平均曲線速度、平均路徑速度分別達到了(120.39±20.78)μm/s、(120.39±20.78)μm/s、 (155.64±12.02)μm/s,與其他各實驗組差異顯著(P0.05)。通過掃描電鏡和透射電鏡觀察新鮮和凍融后的鱈魚精子發(fā)現,鮮精中75.5%精子形態(tài)結構正常、24.5%精子形態(tài)結構異常；運動率最高的凍精中67%精子形態(tài)結構正常、33%精子形態(tài)結構異常。超低溫保存對太平洋鱈精子結構產生了顯著影響,細胞膜破裂、線粒體腫脹變形,鞭毛脫落、斷裂。2.條紋鋸洦精液超低溫冷凍保存研究為建立條紋鋸洦(Centropristis striata)精液超低溫冷凍保存方法,實驗采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析了六種抗凍保護劑(GLY[甘油]、DMSO[二甲基亞砜]、PG[丙二醇]、EG[乙二醇]、MeOH[甲醇]、DMA[二甲基乙酰胺])在四種不同濃度下(5、]0、]5、20%,v/v)對條紋鋸洦精液冷凍保存的效果。結果顯示：以HBSS為稀釋液,采用程序降溫儀分步降溫冷凍保存條紋鋸洦精液,37℃水浴解凍后的精子中,15%PG作為抗凍保護劑的精子運動率最高,達到93.1±0.9%,與鮮精差異不顯著(P0.05),15%PG作為抗凍保護劑的精子水浴解凍后精子的運動速度最高,平均直線速度、平均曲線速度、平均路徑速度分別達到了(88,3±0.3)μm/s、(76.2±0.5)μm/s、 (86.7±0.7)μm/s,與鮮精差異不顯著(P0.05)。在不同種類及不同濃度抗凍保護劑保護下,15%PG作為抗凍保護劑的精子解凍后1mmin內運動率變化與鮮精差異不顯著(P0.05)。研究表明,15%PG為條紋鋸洦最佳抗凍保護劑,可用于條紋鋸洦精液的超低溫冷凍保存。3.太平洋牡蠣精液的超低溫保存研究本研究篩選了六種抗凍保護劑(GLY[甘油],DMSO[二甲基亞砜],PG[丙二醇],EG[乙二醇],DMA[二甲基乙酰胺],MeOH[甲醇])及其五種不同濃度(6%,8%,10%,12%,14%,V/V)、三種稀釋液(無鈣HBSS,人工海水[ASW],過濾海水[FSW])、四種稀釋比例(1：1,1：2,1：4,1：6)、三種添加劑(蔗糖,葡萄糖,海藻糖)、三個分步降溫程序(程序A,程序B,程序C)對太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)精液冷凍保存的影響,成功建立了太平洋牡蠣精液超低溫保存方法：以10%DMSO為抗凍保護劑,無鈣HBSS為稀釋液,1：4的稀釋比例,添加0.45mol/L的海藻糖,采用分布降溫法冷凍保存太平洋牡蠣的精液,37℃水浴解凍后精液運動率達到71.27%±3.24%,顯著高于其它實驗組(P0.05),受精率和孵化率分別達到95.04%±1.99%、93.33%±1.33%,與鮮精(88.89%±15.16%,94.90%±0.95%)、程序冷凍前精液(95.96%±2.15%,92.67%±14.83%)差異不顯著(P0.05),證明該太平洋牡蠣精液超低溫保存方法可以應用于生產實踐和科學研究中。4.太平洋牡蠣精子超低溫冷凍后超微結構損傷研究采用程序降溫儀分步降溫冷凍保存太平洋牡蠣精液,并用掃描電鏡、透射電鏡研究了精子的超微結構損傷。超低溫冷凍保存后太平洋牡蠣精子的運動率、受精率及孵化率與鮮精無顯著差異。鮮精中84.5%的精子形態(tài)結構正常,凍精中73%的精子形態(tài)結構正常。形態(tài)結構正常的精子表現為頂體、質膜、線粒體與鞭毛結構完整、染色質形狀規(guī)則,頂體、線粒體及中心粒結構正常,鞭毛形態(tài)完整、微管結構清晰；形態(tài)結構異常的精子表現為頂體脫落、解體,精子頭部質膜膨脹、破裂、染色質腫脹、破裂、解體,線粒體移位、脫落、膨脹,嵴退化或消失,鞭毛彎折、斷裂,微管解聚。結果顯示,以10% DMSO為抗凍保護劑,HBSS溶液為稀釋液,1：4的稀釋比例,添加海藻糖,采用分步降溫法冷凍保存,對太平洋牡蠣精子具有較好的抗凍保護作用,合適的凍存方法可以有效的保護太平洋牡蠣精子冷凍過程中結構損傷。本研究將有助于太平洋牡蠣種質資源的收集保存及應用。5.太平洋牡蠣擔輪幼蟲的超低溫保存研究本實驗研究了六種抗凍保護劑GLY(甘油)、DMSO(二甲基亞砜)、PG(丙二醇)、EG(乙二醇)、DMA(二甲基乙酰胺)和MET(甲醇)在三種不同濃度下(5%、10%、15%,v/v)對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用及冷凍保存的影響。太平洋牡蠣擔輪幼蟲毒性實驗證明：抗凍保護劑的種類和濃度對太平洋牡蠣擔輪幼蟲產生的毒性強弱不同,在抗凍保護劑濃度為5%時,GLY、DMSO、 PG、EG對太平洋牡蠣的毒性作用顯著低于其他抗凍保護劑(P0.05)；隨著抗凍保護劑濃度增加到10%,GLY、DMSO、EG、MET對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用顯著低于其他抗凍保護劑(P0.05)；而抗凍保護劑濃度為15%時,GLY、DMSO對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用顯著低于其他抗凍保護劑(P0.05),且隨著抗凍保護劑濃度的升高,其對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用也增大。太平洋牡蠣擔輪幼蟲的超低溫冷凍保存實驗證明：以10% DMSO作為抗凍保護劑,采用分步降溫法冷凍保存太平洋牡蠣擔輪幼蟲,28℃水浴解凍后擔輪幼蟲運動率達到(73.00±2.00)%,顯著高于其他實驗組(P0.05),其次為GLY組,且各濃度間差異不顯著(P0.05)。該研究為太平洋牡蠣及其他貝類胚胎保存提供了科學依據,在貝類遺傳育種和生物技術等方面具有一定的應用前景,具有重要的生產實踐價值。
【關鍵詞】：海洋動物 種質 精子 胚胎 超低溫冷凍保存
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 前言15-17
• 第一章 文獻綜述17-28
• 1. 海洋動物種質冷凍保存研究意義17-19
• 2. 海洋動物種質超低溫保存的研究現狀19-24
• 2.1 魚類精子冷凍保存技術研究現狀20
• 2.2 貝類精子冷凍保存技術研究現狀20-21
• 2.3 海水魚類胚胎冷凍保存技術研究現狀21-23
• 2.4 貝類胚胎和卵子冷凍保存技術研究現狀23-24
• 3. 冷凍保存對海洋動物種質質量影響的研究現狀24-25
• 4. 冷凍保存對種質形態(tài)結構的影響25-26
• 5. 冷凍保存時間對種質生理活性的影響26
• 6. 本研究的內容和意義26-28
• 第二章 太平洋鱈精液超低溫冷凍方法的建立及精子超微結構分析28-40
• 1. 材料和方法28-29
• 1.1 樣品采集28
• 1.2 實驗方法28-29
• 1.3 鮮精與凍精的活力測定29
• 1.4 鮮精與凍精的超微結構觀察29
• 1.5 數據處理29
• 2. 結果29-36
• 2.1 添加劑蛋黃對精子運動率的作用29-31
• 2.2 抗凍劑種類和濃度對運動率的影響31
• 2.3 抗凍劑種類和濃度對精子活力的影響31-34
• 2.4 抗凍劑種類和濃度對運動率的影響34-36
• 2.4.1 掃描電鏡觀察結構正常和異常的精子34-35
• 2.4.2 透射電鏡觀察結構正常和結構異常的精子35-36
• 3. 討論36-39
• 3.1 抗凍劑種類和濃度對運動率的影響36-37
• 3.2 抗凍劑種類和濃度對精子活力的影響37-38
• 3.3 抗凍劑種類和濃度對精子運動速度的影響38
• 3.4 太平洋鱈鮮精及凍精的超微結構38-39
• 4. 小結39-40
• 第三章 條紋鋸洦精液超低溫冷凍保存研究40-49
• 1 材料和方法40-41
• 1.1 樣品采集40
• 1.2 實驗方法40-41
• 1.3 鮮精與凍精的活力測定41
• 1.4 數據處理41
• 2 結果41-45
• 2.1 抗凍劑種類和濃度對精子運動率的影響41-42
• 2.2 抗凍劑種類和濃度對精子運動性能的影響42-44
• 2.3 不同濃度不同種類的抗凍劑對精子激活后運動率的影響44-45
• 3 討論45-49
• 3.1 抗凍劑種類和濃度對精子運動率的影響45-46
• 3.2 抗凍劑種類和濃度對精子運動速度的影響46-47
• 3.3 不同濃度和種類抗凍劑激活時間對精子運動率的影響47-49
• 第四章 太平洋牡蠣精液的超低溫保存研究49-61
• 1 材料與方法49-52
• 1.1 太平洋牡蠣的采集49-50
• 1.2 精液活力的檢測50
• 1.3 抗凍保護液的配制50
• 1.4 實驗設計50-52
• 1.4.1 抗凍保護劑種類對太平洋牡蠣精液冷凍保存的影響50
• 1.4.2 抗凍劑濃度對太平洋牡蠣精液冷凍保存效果的影響50
• 1.4.3 三種稀釋液對精液冷凍效果的影響50-51
• 1.4.4 精液與抗凍液稀釋比例對太平洋牡蠣精液冷凍保存效果的影響51
• 1.4.5 不同降溫程序對精液冷凍保存效果的影響51
• 1.4.6 抗凍添加劑對精液冷凍效果的影響51-52
• 1.4.7 受精率和孵化率的測定52
• 1.4.8 統(tǒng)計分析52
• 2 結果52-57
• 2.1 抗凍劑種類對太平洋牡蠣精液冷凍保存效果的影響52-53
• 2.2 抗凍劑濃度對太平洋牡蠣精液保存效果的影響53-54
• 2.3 稀釋液種類對太平洋牡蠣精液保存效果的影響54
• 2.4 不同稀釋比例對太平洋牡蠣精液保存效果的影響54-55
• 2.5 不同添加劑對太平洋牡蠣精液保存效果的影響55
• 2.6 不同降溫程序對太平洋牡蠣精液保存效果的影響55-56
• 2.7 太平洋牡蠣精液超低溫保存對受精率和孵化率的影響56-57
• 3 討論57-61
• 3.1 不同抗凍劑種類對太平洋牡蠣精液保存效果的影響57
• 3.2 不同抗凍劑濃度對太平洋牡蠣精液保存效果的影響57-58
• 3.3 不同稀釋液對太平洋牡蠣精液保存效果的影響58
• 3.4 不同稀釋比例對太平洋牡蠣精液保存效果的影響58-59
• 3.5 不同添加劑對太平洋牡蠣精液保存效果的影響59
• 3.6 不同降溫速率對太平洋牡蠣精液保存效果的影響59-60
• 3.7 太平洋牡蠣精液超低溫冷凍對受精率和孵化率的影響60-61
• 第五章 太平洋牡蠣精子超低溫冷凍后超微結構損傷研究61-74
• 1 材料與方法61-63
• 1.1 實驗材料62
• 1.2 實驗方法62-63
• 1.2.1 精子的超低溫凍存及解凍62
• 1.2.2 鮮精與凍精的活力測定62
• 1.2.3 受精率和孵化率的測定62
• 1.2.4 鮮精與凍精的超微結構觀察62-63
• 1.3 數據處理63
• 2 結果63-70
• 2.1 太平洋牡蠣鮮精及凍精的受精率、孵化率及運動率63
• 2.2 太平洋牡蠣鮮精及凍精的超微結構63-70
• 2.2.1 太平洋牡蠣精子冷凍前后掃描電鏡超微結構63-65
• 2.2.2 太平洋牡蠣精子冷凍前后透射電鏡超微結構65-70
• 3 討論70-72
• 4. 小結72-74
• 第六章 太平洋牡蠣擔輪幼蟲的超低溫保存研究74-83
• 1. 材料與方法75-76
• 1.1 太平洋牡蠣擔輪幼蟲的采集75
• 1.2 實驗方法75-76
• 1.3 太平洋牡蠣擔輪幼蟲活力測定76
• 1.4 數據處理76
• 2 結果76-80
• 2.1 不同濃度及種類的抗凍保護劑對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用76-77
• 2.2 抗凍保護劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔輪幼蟲超低溫保存的影響77-79
• 2.3 太平洋牡蠣擔輪幼蟲超低溫保存方法的篩選79-80
• 3 討論80-83
• 3.1 抗凍保護劑種類和濃度對太平洋牡蠣擔輪幼蟲的毒性作用80-81
• 3.2 太平洋牡蠣擔輪幼蟲的超低溫保存81-83
• 參考文獻83-95
• 致謝95-96
• 個人簡歷96-97
• 論文及專利發(fā)表情況97-98

【相似文獻】

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1 莫棣華;;草魚、■魚、鳙魚、鰱魚精液超低溫冷凍技術研究鑒定會在順德縣舉行[J];畜牧獸醫(yī)科技;1983年02期

2 孫振久;王鳴;;辣椒莖尖超低溫冷凍貯藏研究[J];陜西農業(yè)科學;1990年02期

3 早坂昭二;鲇l⑶а，

本文編號：333249