桑樹是家蠶的主要飼料樹種,且有很高的生態(tài)價值、經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值。鹽和干旱是影響桑樹生長的重要環(huán)境因素,提高桑樹抵抗逆境脅迫的能力有利于促進(jìn)蠶業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和桑樹生態(tài)價值、經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值的實現(xiàn)。桑樹韌皮部汁液中含有豐富的蛋白質(zhì),在信號傳遞、物質(zhì)運輸和植物防御等方面具有重要作用。因此,對韌皮部汁液蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定并對其功能進(jìn)行研究,有助于揭示桑樹的抗逆機(jī)制,為桑樹抗性育種提供候選基因。本課題對桑樹韌皮部汁液蛋白質(zhì)組進(jìn)行了高通量分析,對鑒定到的溴結(jié)構(gòu)域蛋白（Bromodomain-containing protein 1）基因（Mul-BRD1）進(jìn)行了克隆,并對其表達(dá)特性和生物學(xué)功能進(jìn)行了研究,同時篩選鑒定出了Mul-BRD1蛋白的相互作用蛋白質(zhì)。研究結(jié)果有助于深入了解植物韌皮部的功能及其對環(huán)境響應(yīng)的分子機(jī)制和信號傳導(dǎo)途徑,為桑樹抗性育種提供了候選基因,同時也為深入研究Mul-BRD1基因的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:（1）桑樹韌皮部汁液蛋白質(zhì)組研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對桑樹韌皮部汁液蛋白質(zhì)組進(jìn)行了高通量分析,鑒定了712種蛋白質(zhì),其功能可分為20類,其中最豐富的類別是與... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

溴結(jié)構(gòu)域蛋白的分類（Filippakopoulosetal.,2012）

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文23凝膠進(jìn)行電泳檢測，并用膠回收試劑盒回收所酶切的目的DNA條帶。將DNA目的片段與經(jīng)過同樣雙酶切的植物表達(dá)載體pBI121相連接，連接反應(yīng)體系如下：將上述反應(yīng)液加入到已滅菌的250μL離心管中，通過移液槍吹吸混勻，16C過夜連接12h。取適量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，用涂布器涂布于含有卡那霉素（Kan+）抗生素的固體LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同2.2.2.3，篩選陽性菌株。獲得陽性質(zhì)粒后測序。圖2-1植物表達(dá)載體pBI121-Mul-BRD1構(gòu)建示意圖Fig.2-1ConstructionofplantexpressionvectorpBI121-Mul-BRD12.2.3.3植物表達(dá)載體pROKII-MulBRD1-GFP的構(gòu)建根據(jù)該基因的核苷酸序列信息，設(shè)計含有酶切位點的特異性引物Mul-BRD1-5"（BamHI）和Mul-BRD1-3"（KpnI），并用帶有酶切位點的引物，以陽性質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件和體系同2.2.2.3，回收目的基因片段，連接克隆載體pMD19-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR篩選陽性克隆，擴(kuò)增體系和條件同2.2.2.3，按照步驟2.2.3.1提取陽性質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，雙酶切反應(yīng)以及表達(dá)載體與目的片段連反應(yīng)液體積目的DNA片段（50ng/μL）5.5μL酶切后質(zhì)粒載體（21ng/μL）2.0μLT4Buffer2.0μLT4DNA連接酶（10U/μL）0.5μLTotal10.0μLSalⅠ35SpromoteroriKanrBamHⅠMul-BRD1SalⅠ35SpromoteroriKanrGUSBamHIpBI121T4LigaseBamHⅠSalⅠMul-BRD1BamHⅠ+SalⅠpBI121-Mul-BRD1

桑樹韌皮部汁液蛋白質(zhì)的鑒定及Mul-BRD1蛋白的功能研究24接轉(zhuǎn)化獲得陽性質(zhì)粒體系同2.2.3.2。圖2-2植物表達(dá)載體pROKII-MulBRD1-GFP構(gòu)建示意圖Fig.2-2ConstructionofplantexpressionvectorpROKII-MulBRD1-GFP2.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得2.2.4.1農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（1）從-80C冰箱中取保存的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化。（2）在超凈工作臺中操作，吸取40μL感受態(tài)細(xì)胞放于干凈的1.5mL離心管中，向其加入適量重組質(zhì)粒DNA，用移液槍輕輕吹吸混勻，在冰盒上靜置30min。（3）將液氮倒入保溫桶中，隨后立即用液氮處理加入重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞1min，再于37℃中水浴5min。（4）在超凈工作臺上，向離心管中加入960μL不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28C恒溫震蕩培養(yǎng)箱，250rpm培養(yǎng)3h，室溫，7000g離心1min，棄上清，加入100μLLB液體培養(yǎng)基吸打沉淀，懸浮菌體。（5）吸取40μL懸浮細(xì)胞涂布于含50mg/LKan+的LB固體培養(yǎng)皿上，28C倒置培養(yǎng)36-48h。（6）挑取單個菌落接種于含有400μLLB（50mg/LKan+）液體培養(yǎng)基的1.5mL離心管中，于28C培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)5-7h。（7）菌液PCR檢測：以1μL培養(yǎng)的菌液為模板，進(jìn)行菌液PCR鑒定，反應(yīng)體系同2.2.2.3。（8）選取得到的陽性克隆菌液，接種于含有10mLLB（50mg/LKan+）液體培養(yǎng)基的50mL錐形瓶中過夜培養(yǎng)14-16h后加甘油保存菌種（菌液:甘油=3:1），于-80C保KpnⅠ35SpromoteroriBamHⅠMul-BRD1BamHⅠ35SpromoteroriEGFPKpnⅠpROKIIT4LigaseBamHⅠKpnⅠMul-BRD1BamHⅠ+KpnⅠpROKII-MulBRD1-GFPEGFP

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]BRD4-DNA相互作用促進(jìn)雙共價的染色質(zhì)結(jié)合[J]. 谷銳銳,韓欣冶,喻笛,賈艷杰,王琪,曾雷.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2020(05)
[2]水稻響應(yīng)缺鐵的韌皮部汁液蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J]. 陳琳,林焱,陳鵬飛,王紹華,丁艷鋒.  植物學(xué)報. 2019(02)
[3]芹菜韌皮部蛋白質(zhì)AgPP2-2基因的克隆與表達(dá)[J]. 賈曉玲,王楓,馬靜,劉君,徐馨琰,熊愛生.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2014(02)
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博士論文
[1]溴結(jié)構(gòu)域蛋白BRD4維持胃癌細(xì)胞高侵襲轉(zhuǎn)移特性的作用及機(jī)制研究[D]. 覃中毅.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué) 2019
[2]南瓜韌皮液mRNA結(jié)合蛋白的純化與CmRBP50核糖核蛋白復(fù)合體形成的分子機(jī)制[D]. 李蘋芳.浙江大學(xué) 2011

碩士論文
[1]桑樹韌皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的生物學(xué)功能研究[D]. 郭方月.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]桑樹韌皮部汁液植原體響應(yīng)基因的研究[D]. 袁傳忠.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3330297