本文關(guān)鍵詞：利用Myf5誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：生肌因子5(Myf5)為生肌決定因子(MyoD)基因家族。MyoD基因家族包括生肌決定因子MyoD肌細(xì)胞生成素(Myogenin)、生肌因子5(Myf5)和生肌調(diào)節(jié)因子4(Mrf4),它們具有單獨(dú)或協(xié)同調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的增殖和分化、肌纖維大小和數(shù)量等功能。為了建立利用小鼠Myf5基因誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的方法,本研究在克隆小鼠Myf5基因的cDNA基礎(chǔ)上,依次通過克隆載體pMD18-T Simple和表達(dá)載體pcDNA3.1(+)相連,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myf5;采用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-Myf5轉(zhuǎn)染綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,以觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞分化形成成肌細(xì)胞的能力。其研究結(jié)果如下：1.Myf5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建參照GenBank (AK044894)中序列,通過PCR擴(kuò)增提取小鼠肌肉組織中的總RNA,擴(kuò)增獲得Myf5基因,與克隆載體pMD18-T Simple相連,通過雙酶切和測序鑒定后,與表達(dá)載體pcDNA3.1(+)表達(dá)載體連接。經(jīng)雙酶切鑒定和測序結(jié)果顯示,與理論序列相符,表明成功獲得Myf5基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myf5;2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分化將冷凍保存的綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)復(fù)蘇后進(jìn)行傳代培養(yǎng),其結(jié)果,培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)正常的形態(tài)和生長曲線；當(dāng)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞約達(dá)到80%匯合時,分別進(jìn)行下列處理。A組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myf5無內(nèi)毒素質(zhì)粒,并加入含有0.5%DMSO的F12培養(yǎng)基；B組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myf5無內(nèi)毒素質(zhì)粒,加入F12培養(yǎng)基；C組：含0.5%DMSO的F12培養(yǎng)基。當(dāng)轉(zhuǎn)染后第12d開始,在倒置顯微鏡下,3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均呈現(xiàn)成肌細(xì)胞樣的細(xì)管狀形態(tài)。3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞生物學(xué)檢測(1)免疫熒光檢測在轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的第17d,將上述3種細(xì)胞和作為對照未經(jīng)轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用兔MyoD、MyoG、DES抗體處理進(jìn)行免疫熒光檢測。其結(jié)果,與對照組不發(fā)生綠色熒光相比,三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞均出現(xiàn)綠色熒光；(2)流式細(xì)胞篩選在轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的第21d,利用BD Accuri-C6個人型流式細(xì)胞儀對3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞篩選檢測,其結(jié)果,三組細(xì)胞中三種基因表達(dá)(Desmin、MyoD、MyoG)都在96.4%以上(A組,98.6%、99.9%、96.9%；B組,99.9%、98.0%、99.1%;C組,97.4%、96.4%、99.9%)(3) Real-Time PCR檢測在轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的第28d,對上述三種細(xì)胞和作為對照的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用實時定量PCR檢測(選取三對引物分別為MyoG,Myf5和Desmin,一組內(nèi)參引物GAPDH)。其結(jié)果,與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)化為1)相比,上述三種處理組的Myf5、MyoG和Desmi的相對表達(dá)量與均升高(A組分別為5.126±0.01倍、4.315±0.01倍和3.099+0.01倍；B組分別為4.484±0.01倍、3.124±0.01倍和2.889±0.01倍；C組分別為3.321±0.01倍、2.557±0.01倍和2.712±0.01倍)。上述結(jié)果表明,利用小鼠Myf5基因構(gòu)建的pcDNA3.1-Myf5真核表達(dá)載體可以誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞。為BMSCs在組織工程中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
【關(guān)鍵詞】：Myf5 綿羊 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 誘導(dǎo) 成肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826;Q813
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-17
• 1.1 生肌因子5(Myf5)10-12
• 1.1.1 生肌因子5(Myf5)10-11
• 1.1.2 生肌因子5(Myf5)基因的功能11
• 1.1.3 生肌因子5(Myf5)基因調(diào)控機(jī)制11-12
• 1.2 骨髓間充質(zhì)于細(xì)胞12-15
• 1.2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的來源12-13
• 1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞13-14
• 1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方式14
• 1.2.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化及應(yīng)用14-15
• 1.3 研究目的和意義15-17
• 2 小鼠Myf5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建17-28
• 2.1 實驗材料17-19
• 2.1.1 實驗動物及菌株17
• 2.1.2 載體信息17
• 2.1.3 主要藥品與試劑17-18
• 2.1.4 常用溶液的配置18-19
• 2.1.5 儀器與設(shè)備19
• 2.2 實驗方法19-25
• 2.2.1 小鼠的Myf5基因的提取、克隆和序列分析19-24
• 2.2.2 小鼠Myf5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建24-25
• 2.3 實驗結(jié)果25-27
• 2.3.1 小鼠Myf5基因的克隆與序列分析25-26
• 2.3.2 小鼠Myf5基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建26-27
• 2.4 討論27
• 2.5 本章小結(jié)27-28
• 3. 轉(zhuǎn)Myf5綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化28-43
• 3.1 實驗材料28
• 3.1.1 實驗細(xì)胞28
• 3.2 實驗藥品與器材28-29
• 3.2.1 實驗藥品28
• 3.2.2 實驗試劑28-29
• 3.2.3 實驗器材29
• 3.3 實驗方法29-33
• 3.3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)29
• 3.3.2 Myf5的轉(zhuǎn)染29-30
• 3.3.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化30
• 3.3.4 檢測30-33
• 3.4 實驗結(jié)果33-41
• 3.4.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線33
• 3.4.2 轉(zhuǎn)染Myf5基因的細(xì)胞狀態(tài)和陽性對照33-35
• 3.4.3 免疫熒光35-38
• 3.4.4 流式細(xì)胞分析38-39
• 3.4.5 實時定量PCR39-41
• 3.5 討論41
• 3.6 本章小結(jié)41-43
• 4 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 附錄51-53
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文53-54
• 致謝54-55

【相似文獻(xiàn)】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 尹華東;邱莫寒;肖禮華;胡耀東;朱慶;;雞Myf5基因多態(tài)性及其與屠體和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析[A];中國動物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王皓;利用Myf5誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

2 樸海仙;松遼白鵝Myf5外顯子Ⅰ基因克隆與序列分析[D];延邊大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：利用Myf5誘導(dǎo)綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：331896