本文關(guān)鍵詞：小麥矮縮病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系在小麥和異沙葉蟬中的建立與應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus, WDV)屬于聯(lián)體病毒科玉米線條病毒屬,通過(guò)異沙葉蟬(Psammotettix striatus L.)介體以持久循回性方式傳播,小麥矮縮病害的發(fā)生與傳播與WDV、異沙葉蟬介體以及小麥寄主之間的互作息息相關(guān)。這種互作涉及三者相關(guān)基因的表達(dá)。已有研究表明,聯(lián)體病毒科的病毒粒子在植物細(xì)胞間的運(yùn)輸需要病毒的衣殼蛋白(Coat Protein, CP),它輔助運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement Protein, MP)調(diào)控胞間連絲的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,同時(shí),WDV的CP蛋白參與WDV與異沙葉蟬之間的互作。為準(zhǔn)確、相對(duì)定量地分析WDV相關(guān)基因在小麥和介體的表達(dá),本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了WDV在小麥和異沙葉蟬體內(nèi)的RT-qPCR體系。(1)選擇小麥的5個(gè)持家基因TEF-1-α、GAPDH、18SrRNA、UBC和28SrRNA作為內(nèi)參基因,以3種統(tǒng)計(jì)分析軟件Genorm、NormFinder和Bestkeeper分析內(nèi)參基因在小麥莖和葉兩種組織中的表達(dá)穩(wěn)定性。小麥莖中,TEF-1-α最穩(wěn)定,而28SrRNA最不穩(wěn)定。小麥葉中,由于三種軟件結(jié)果不一致,很難確定最穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。但是,小麥莖、葉中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合都是TEF-1-α和GAPDH。同時(shí),由Genorm軟件計(jì)算內(nèi)參基因之間的配對(duì)變異Vn/Vn+1,判斷莖和葉組織中用于標(biāo)準(zhǔn)化的最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)目至少5個(gè)。(2)利用建立好的體系檢測(cè)了WDV-CP基因在小麥莖、葉兩種組織中的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示W(wǎng)DV-CP基因在小麥莖中的表達(dá)量普遍高于小麥葉,這可能與WDV病毒粒體通過(guò)異沙葉蟬進(jìn)入植物韌皮部組織,韌皮部的運(yùn)輸方向?yàn)橛芍参镯敹讼蚋窟\(yùn)輸,因此有大量的WDV病毒粒體存在于莖部。(3)首次克隆并測(cè)序了異沙葉蟬6個(gè)持家基因RPS23e、UBC、Beta-TUB、GAPDH、18SrRNA和ACT2。以這6個(gè)持家基因?yàn)閮?nèi)參基因,構(gòu)建了RT-qPCR相對(duì)定量體系并利用Genorm、 NormFinder和Bestkeeper軟件分析這6個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,三個(gè)軟件分析后均指出RPS23e最穩(wěn)定,ACT2最不穩(wěn)定,Beta-TUB和UBC是最穩(wěn)定的組合。Genorm軟件計(jì)算出用于標(biāo)準(zhǔn)化的最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)目至少6個(gè)。(4)利用構(gòu)建的體系分析了不同取食時(shí)間點(diǎn)(12 h-156 h,每隔12 h為一個(gè)時(shí)間點(diǎn))WDV-CP基因在異沙葉蟬中表達(dá)量的趨勢(shì)：12 h-48 h遞減,48 h-96 h開(kāi)始增加,96 h達(dá)到最高,96 h-120 h遞減,120 h-156 h再一次遞增。昆蟲(chóng)體內(nèi)病毒表達(dá)量下降可能是存在唾液腺的病毒粒體由介體口器進(jìn)入植物韌皮部,而后出現(xiàn)上升是由于持久循回性病毒傳播的病毒只能局限在植物韌皮部中復(fù)制,當(dāng)葉蟬繼續(xù)吸食韌皮部,韌皮部中的病毒粒體再次進(jìn)入介體體內(nèi)。如此反復(fù),WDV-CP基因的表達(dá)量在異沙葉蟬體內(nèi)為一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。綜述所述,利用構(gòu)建的RT-qPCR體系可以成功檢測(cè)WDV在小麥和異沙葉蟬體內(nèi)表達(dá)量的變化,有助于研究WDV與小麥和介體之間的互作。
【關(guān)鍵詞】：WDV RT-qPCR 小麥 異沙葉蟬
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.41
【目錄】：

• 摘要5-6
• abstract6-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-23
• 1.1 植物病毒的致病機(jī)制12-14
• 1.1.1 抑制植物的抗病反應(yīng)12-13
• 1.1.2 干擾激素調(diào)控13
• 1.1.3 干擾細(xì)胞周期和基因表達(dá)13-14
• 1.2 植物病毒昆蟲(chóng)介體傳毒機(jī)制14-15
• 1.2.1 昆蟲(chóng)介體傳毒方式14
• 1.2.2 昆蟲(chóng)介體傳毒機(jī)制14-15
• 1.3 基因表達(dá)的分析方法15-17
• 1.3.1 Northern雜交16
• 1.3.2 基因表達(dá)系列分析16
• 1.3.3 相對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽16
• 1.3.4 大規(guī)模平行標(biāo)記測(cè)序16
• 1.3.5 DNA微陣列16-17
• 1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR17
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇17-18
• 1.4.1 內(nèi)參基因選擇的標(biāo)準(zhǔn)17
• 1.4.2 內(nèi)參基因選擇的方法17-18
• 1.5 小麥內(nèi)參候選基因的研究進(jìn)展18
• 1.6 植物病毒昆蟲(chóng)介體(半翅目)內(nèi)參候選基因的研究進(jìn)展18-19
• 1.7 小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus,WDV)19-21
• 1.7.1 WDV的生物學(xué)特點(diǎn)與研究進(jìn)展19-21
• 1.7.2 WDV的傳毒介體異沙葉蟬(P.striatus L.)21
• 1.8 研究的目的與意義21-23
• 第二章 小麥體內(nèi)WDV實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的建立與應(yīng)用23-41
• 2.1 材料與方法23-31
• 2.1.1 材料23-24
• 2.1.2 方法24-31
• 2.2 結(jié)果與分析31-39
• 2.2.1 從健康小麥和帶毒小麥中提取總RNA電泳圖31-32
• 2.2.2 內(nèi)參基因和WDV-CP基因擴(kuò)增效率和特異性檢測(cè)32-33
• 2.2.3 檢測(cè)健康對(duì)照小麥和處理組小麥莖和葉的總RNA33-34
• 2.2.4 檢測(cè)處理組小麥莖、葉組織的普通RT-PCR產(chǎn)物34
• 2.2.5 五個(gè)內(nèi)參基因C_T值的箱線分布圖34-35
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析內(nèi)參基因的C_T值差異35-36
• 2.2.7 分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性36-37
• 2.2.8 選擇合適的內(nèi)參基因數(shù)目37-38
• 2.2.9 WDV-CP基因在小麥莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量38-39
• 2.3 討論39-41
• 第三章 異沙葉蟬體內(nèi)WDV實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的建立與應(yīng)用41-58
• 3.1 材料與方法41-48
• 3.1.1 材料41
• 3.1.2 方法41-48
• 3.2 結(jié)果與分析48-56
• 3.2.1 檢測(cè)異沙葉蟬帶毒率48
• 3.2.2 單頭無(wú)毒的異沙葉蟬成蟲(chóng)總RNA48-49
• 3.2.3 內(nèi)參基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果49-50
• 3.2.4 分析異沙葉蟬內(nèi)參基因核苷酸序列的相似性50-51
• 3.2.5 14個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 h-156 h)單頭異沙葉蟬總RNA51-52
• 3.2.6 內(nèi)參基因擴(kuò)增效率和特異性檢測(cè)52-53
• 3.2.7 分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性53-54
• 3.2.8 選擇合適內(nèi)參基因數(shù)目54-55
• 3.2.9 不同取食時(shí)間點(diǎn)WDV-CP基因在異沙葉蟬體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量55-56
• 3.3 討論56-58
• 第四章 全文總結(jié)與展望58-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄66-69
• 致謝69-70
• 作者簡(jiǎn)歷70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 安德榮,魏寧生,張秦風(fēng),張榮,朱象三;小麥蘭矮病病原物——類菌原體的初報(bào)[J];植物病理學(xué)報(bào);1991年04期

  本文關(guān)鍵詞：小麥矮縮病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系在小麥和異沙葉蟬中的建立與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：332085