本文關(guān)鍵詞：羅非魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定及基因分型研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：海南自然環(huán)境適宜,水質(zhì)優(yōu)良,是我國羅非魚(Oreochromis niloticus)主要養(yǎng)殖區(qū)域之一,產(chǎn)量位居全國第二,海南養(yǎng)殖的羅非魚及其制品多用于出口,2011、2012年連續(xù)兩年出口量位居全國第一,平均年出口量達(dá)到9.88萬噸。但隨著養(yǎng)殖面積不斷擴(kuò)大和產(chǎn)量不斷提高,羅非魚病害越來越多,暴發(fā)范圍越來越大,其中細(xì)菌性疾病尤為嚴(yán)重,給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)是一種新型的人-畜-魚共患病病原菌,廣泛的存在于土壤、自然水體、養(yǎng)殖水體中。近年來,其感染的水產(chǎn)動物種類越來越多,傳播范圍非常廣泛。目前,國內(nèi)有關(guān)羅非魚源維氏氣單胞菌患病的報道很少,在海南還未發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌感染羅非魚的報道。2014年3-5月海南省羅非魚主養(yǎng)區(qū)多個養(yǎng)殖場發(fā)生暴發(fā)性疾病,作者從海南羅非魚養(yǎng)殖場患病個體中分離出優(yōu)勢菌,進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn),并采用生理生化和16SrRNA序列分析,確定此次羅非魚暴發(fā)性疾病病原菌為維氏氣單胞菌。鑒于維氏氣單胞菌的對人具有潛在致病性,作者對市場、養(yǎng)殖場及天然池塘中的羅非魚進(jìn)行檢測,從不同來源羅非魚體內(nèi)分離獲得40株維氏氣單胞菌,之后對這40株維氏氣單胞菌進(jìn)行8種毒力基因的分布情況研究,并根據(jù)不同菌株間毒力基因的差異以及采用ERIC-PCR技術(shù)進(jìn)行基因分型研究。具體研究方法和結(jié)果如下： 2014年3-5月海南省羅非魚主養(yǎng)區(qū)多個養(yǎng)殖場發(fā)生暴發(fā)性疾病,從患病羅非魚不同組織中分離獲得12株優(yōu)勢菌。經(jīng)人工回歸感染實(shí)驗(yàn),從肝臟和腦中分離獲得的HN-G-03和HN-B-02菌株具較強(qiáng)的致病力,HN-G-03和HN-B-02菌株對羅非魚的的半致死濃度LDso分別為7.12×105CFU/尾和1.32×105CFU/尾。經(jīng)16SrRNA和gyrB基因序列分析,同時結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征,生理生化特征,菌株HN-G-03和HN-B-02分別被鑒定為維氏生物型維氏氣單胞菌和溫和生物型維氏氣單胞菌。體外藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,兩株菌均對左氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、慶大霉素等5種藥物高度敏感,對呋喃妥因等3種藥物中度敏感,對青霉素等12種藥物呈較強(qiáng)的耐藥性。 2014年5-8月期間,從海南羅非魚養(yǎng)殖場、市場、野生池塘等6個地點(diǎn)采集羅非魚,利用氣單胞菌選擇性培養(yǎng)基RS從羅非魚體內(nèi)分離出疑似氣單胞菌152株,通過氧化酶、接觸酶、O/F實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩,然后將三個生化指標(biāo)全是陽性的菌株通過氣單胞菌屬特定的16S rDNA引物進(jìn)行確認(rèn),共篩選出71株,最后利用gyrB基因序列分析確定其中40株為維氏氣單胞菌。對40株維氏氣單胞菌的細(xì)胞毒性腸毒素act、細(xì)胞興奮性腸毒素aJt、熱穩(wěn)定性腸毒素ast、氣溶素aerA、溶血素hlyA、脂肪酶lip、鞭毛基因fla以及菌毛基因tapA8種毒力基因進(jìn)行檢測。其中aerA和tapA的陽性檢出率率為0,act陽性率為35%,alt陽性率為22.5%,ast陽性率為27.5%,hlyA陽性率為15%,lip陽性率為5%,fla陽性率為37.5%。40株維氏氣單胞菌中,act+alt+ast+毒力基因型菌株陽性率為7.7%,隨機(jī)帶有1個或2個腸毒素基因的菌株陽性率為50%。 基于毒力基因的分布情況,采用平均連鎖法(UPGMA)構(gòu)建聚類樹狀圖,結(jié)果可將40株維氏氣單胞菌分為14個毒力基因型,8個簇,其中Ⅷ型數(shù)量最多,有15株,來自于養(yǎng)殖環(huán)境與野生環(huán)境的菌株毒力基因呈明顯的隨機(jī)交叉分布；利用ERIC-PCR技術(shù)對40株維氏氣單胞菌進(jìn)行基因分型,ERIC電泳圖顯示主條帶有4種,大小范圍在800-6000bp之內(nèi),采用NTSYS2.1pc軟件構(gòu)建遺傳相似圖,以遺傳相似度90%為界可將分離菌株分為18個基因型,其中有8株菌呈獨(dú)立的基因型存在,按來源分類,養(yǎng)殖魚源與野生魚源的指紋圖譜呈明顯混合式分布。
【關(guān)鍵詞】：羅非魚 維氏氣單胞菌 gyrB基因 毒力基因 ERIC-PCR
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S943
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 綜述11-20
• 1 海南羅非魚養(yǎng)殖概況11
• 2 羅非魚主要細(xì)菌性疾病11-13
• 2.1 羅非魚生物學(xué)特性11
• 2.2 羅非魚細(xì)菌性疾病簡介11-12
• 2.3 羅非魚細(xì)菌性疾病的防治12-13
• 3 維氏氣單胞菌研究進(jìn)展13-16
• 3.1 維氏氣單胞菌的分類地位13
• 3.2 維氏氣單胞菌的生物學(xué)特征13-14
• 3.3 維氏氣單胞菌的致病性及流行性14-16
• 3.3.1 維氏氣單胞菌的致病性14-15
• 3.3.2 維氏氣單胞菌的分布及流行情況15
• 3.3.3 維氏氣單胞菌的主要毒力基因15-16
• 4 管家基因序列鑒定和分析16-17
• 4.1 gyrB基因簡介16-17
• 4.2 gyrB基因在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用17
• 5 ERIC-PCR基因分型17-19
• 5.1 基因分型簡介17-18
• 5.2 ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)簡介18
• 5.3 ERIC-PCR的應(yīng)用18-19
• 6 本文的目的和意義19-20
• 第二章 海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌的分離、純化和鑒定20-39
• 1 材料與方法20-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料20
• 1.2 主要試劑與培養(yǎng)基20-22
• 1.2.1 主要試劑及其配制20-21
• 1.2.2 主要培養(yǎng)基及其配置21
• 1.2.3 主要儀器21-22
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法22-28
• 1.3.1 病原菌的分離純化與培養(yǎng)22
• 1.3.2 人工感染實(shí)驗(yàn)22-23
• 1.3.3 病原菌對羅非魚半數(shù)致死劑量LD50的計算23
• 1.3.4 病原菌的革蘭氏染色23
• 1.3.5 細(xì)菌DNA的提取23-24
• 1.3.6 病原菌16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建24-27
• 1.3.7 管家基因gyrB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建27
• 1.3.8 生理生化鑒定27-28
• 1.3.9 藥敏實(shí)驗(yàn)28
• 2 結(jié)果與分析28-36
• 2.1 患病羅非魚癥狀與病原菌形態(tài)學(xué)觀察28-29
• 2.2 人工感染實(shí)驗(yàn)29
• 2.3 病原菌LD50的測定29-30
• 2.4 16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建30-32
• 2.5 管家基因gyrb序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建32-33
• 2.6 生理生化特性33-35
• 2.7 藥敏試驗(yàn)35-36
• 3 討論36-39
• 第三章 羅非魚源維氏氣單胞菌的分離鑒定及毒力基因分布研究39-53
• 1 材料與方法39-44
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料39-40
• 1.1.1 菌株及羅非魚來源39-40
• 1.2 主要試劑及儀器40-41
• 1.2.1 主要試劑及其配制40
• 1.2.2 主要儀器40-41
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 1.3.1 維氏氣單胞菌的分離純化與保存41
• 1.3.2 維氏氣單胞菌的初步篩選41
• 1.3.3 細(xì)菌DNA模板的制備41
• 1.3.4 氣單胞菌的分子鑒定41-42
• 1.3.5 gyrB基因序列擴(kuò)增及測序42
• 1.3.6 維氏氣單胞菌毒力基因檢測42-44
• 2 結(jié)果44-50
• 2.1 細(xì)菌的分離44-45
• 2.2 病原菌的初步篩選45
• 2.3 氣單胞菌的分子標(biāo)記鑒定45
• 2.4 維氏氣單胞菌的gyrB基因鑒定45-46
• 2.5 維氏氣單胞菌毒力基因的檢測46-50
• 3 討論50-53
• 第四章 維氏氣單胞菌的基因分型53-60
• 1 材料與方法53-54
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料53
• 1.2 主要試劑及儀器53
• 1.2.1 主要試劑及其配制53
• 1.2.2 主要儀器53
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法53-54
• 1.3.1 基于毒力基因的基因分型53
• 1.3.2 ERIC-PCR53-54
• 1.3.3 數(shù)據(jù)處理54
• 2 結(jié)果54-58
• 2.1 維氏氣單胞菌毒力基因聚類分析圖(UPGMA)54-56
• 2.2 不同來源維氏氣單胞菌毒力基因聚類圖分析56
• 2.3 維氏氣單胞菌ERIC-PCR擴(kuò)增片段56
• 2.4 維氏氣單胞菌ERIC-PCR指紋圖譜聚類樹狀圖(UPGMA)56-58
• 3 討論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-69
• 作者攻讀學(xué)位期間論文發(fā)表情況69-70
• 致謝70

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