本文關(guān)鍵詞：四個(gè)小麥品種上白粉菌的侵染過(guò)程觀察及基因差異表達(dá)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：小麥白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的小麥白粉病是世界各個(gè)小麥主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一,目前防治白粉病最為有效的措施是抗病育種。然而,小麥白粉菌變異極快,導(dǎo)致小麥品種抗性喪失加快,抗性品種使用年限大大縮短,嚴(yán)重威脅了小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此,對(duì)小麥白粉菌變異機(jī)制的研究具有重要意義。本研究采用mRNA差異顯示分析技術(shù),探索小麥白粉菌在不同小麥品種上的基因表達(dá)差異,分離差異表達(dá)的基因片段,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。1.從田間采集白粉菌,分離純化后,轉(zhuǎn)接到四個(gè)含有不同抗性基因的小麥品種川農(nóng)26、川育20、西科2號(hào)、內(nèi)麥12上,并對(duì)小麥白粉菌的侵染過(guò)程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察,顯微觀察白粉菌分生孢子侵染初期的芽管長(zhǎng)度變化及乳突的形成情況。結(jié)果表明,小麥白粉菌在抗、感材料上分生孢子形成芽管的長(zhǎng)度有明顯差異,乳突形成時(shí)間基本一致,而抗性材料上乳突形成百分率在28h后仍保持在較高水平,與感病材料差異明顯。2.接種后,分別從四個(gè)小麥品種上收集白粉菌分生孢子,提取RNA,反轉(zhuǎn)錄,對(duì)DDRT一PCR條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明：DNA Taq聚合酶2.5U、退火溫度40℃、引物濃度100uM最為適宜。以3個(gè)錨定引物和26個(gè)隨機(jī)引物組合,共78對(duì)引物組合,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版進(jìn)行DDRT-PCR,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后,共找出差異片段44條。3.將部分差異片段進(jìn)行測(cè)序,得到四個(gè)測(cè)序結(jié)果(B-1、B-2、B-3、B-4),利用軟件和在線分析工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析。B-1,序列長(zhǎng)度129bp,來(lái)源于川育20上收集的白粉菌CY20,引物組合B0327/B0310。該片段的推定蛋白與來(lái)自小麥白粉菌菌株96224的序列有60%的相似性,編碼產(chǎn)物為鞘氨醇C4羥化酶。該推定蛋白共43個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為5.131KD,等電點(diǎn)為11.543,不穩(wěn)定性系數(shù)為58.54,屬于不穩(wěn)定蛋白,脂溶指數(shù)為54.42,總平均親水性為-1.342。PredictProtein預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋16.28%,β-折疊23.26%,9-轉(zhuǎn)角60.47%。該蛋白的最大疏水指數(shù)為1.344,最小疏水指數(shù)為-3.356。B-2,序列長(zhǎng)度674bp,來(lái)源于西科2號(hào)上收集的白粉菌XK2,引物組合B0328/B0302,將其最長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框264bp翻譯為氨基酸序列,與來(lái)自小麥白粉菌菌株96224的序列的相似性為60%,其功能是編碼核糖體線粒體蛋白。該序列推定蛋白共87個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為9.496KD,等電點(diǎn)為5.421,不穩(wěn)定性系數(shù)為49.04,屬于不穩(wěn)定蛋白,脂溶指數(shù)為98.74,總平均親水性為-0.014。PredictProtein預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋6.90%,β-折疊22.99%,β-轉(zhuǎn)角70.11%。該蛋白的最大疏水指數(shù)為2.322,最小疏水指數(shù)為-1.756。B-3,序列長(zhǎng)度323bp,來(lái)源于川農(nóng)26上收集的白粉菌CN26,引物組合B0328/B0305,通過(guò)在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)和分析,發(fā)現(xiàn)此序列與小麥白粉菌菌株96224的序列相似,相似性為52%,其功能是編碼凝集素相關(guān)蛋白。該序列的推定蛋白分子質(zhì)量為10.661KD,等電點(diǎn)為9.032,不穩(wěn)定性系數(shù)為29.01,屬于穩(wěn)定蛋白,脂溶指數(shù)為123.26,總平均親水性為0.764。PredictProtein預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含a-螺旋72.63%,β-折疊4.21%,β-轉(zhuǎn)角23.16%。該蛋白的最大疏水指數(shù)為3.333,最小疏水指數(shù)為-3.044。B-4,序列長(zhǎng)度204bp,來(lái)源于內(nèi)麥12上收集的白粉菌NM12,引物組合B0328/B0313,該片段的推定蛋白與來(lái)自小麥白粉菌菌株96224的序列有64%的相似性,編碼產(chǎn)物是假定蛋白,功能目前還不清楚。該序列的推定蛋白分子質(zhì)量為6.387KD,等電點(diǎn)為9.18,不穩(wěn)定性系數(shù)為75.63,屬于不穩(wěn)定蛋白,脂溶指數(shù)為62.68,總平均親水性為-1.125。redictProtein預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋0%,β-折疊23.21%,β-轉(zhuǎn)角76.79%。該蛋白的最大疏水指數(shù)為1.022,最小疏水指數(shù)為-3.189。
【關(guān)鍵詞】：小麥白粉菌 侵染過(guò)程 DDRT-PCR 相似性比對(duì) 生物信息學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.121.46
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1.1 小麥白粉病的研究現(xiàn)狀10-17
• 1.1.1 小麥白粉病發(fā)生分布和危害10
• 1.1.2 病原菌10-11
• 1.1.3 病害癥狀11
• 1.1.4 病原菌生物學(xué)特性11
• 1.1.5 病害侵染循環(huán)11-12
• 1.1.6 小麥抗白粉病基因的類型、位點(diǎn)和來(lái)源12-15
• 1.1.7 小麥白粉菌的變異15-16
• 1.1.8 侵染過(guò)程觀察16-17
• 1.2 幾種基因差異表達(dá)研究方法的比較17-20
• 1.2.1 抑制差減雜交(SSH)17-18
• 1.2.2 基因芯片技術(shù)(DNA microarray)18-19
• 1.2.3 mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)19-20
• 1.3 mRNA差異顯示技術(shù)在各領(lǐng)域中的應(yīng)用20-21
• 2 研究的主要目的意義21-22
• 3 材料與方法22-30
• 3.1 試驗(yàn)材料22-23
• 3.1.1 供試菌株及小麥品種22
• 3.1.2 主要試劑22-23
• 3.1.3 儀器設(shè)備23
• 3.2 試驗(yàn)方法23-30
• 3.2.1 白粉菌的分離純化23
• 3.2.2 白粉菌的擴(kuò)繁23-24
• 3.2.3 供試材料接種24
• 3.2.4 離體抗性鑒定24-25
• 3.2.5 侵染過(guò)程觀察25
• 3.2.6 白粉菌的收集25
• 3.2.7 總RNA提取25-26
• 3.2.8 cDNA第一條鏈的合成26
• 3.2.9 PCR條件的優(yōu)化26-27
• 3.2.10 DDRT-PCR27-28
• 3.2.11 差異片段的統(tǒng)計(jì)28-29
• 3.2.12 差異片段的序列測(cè)定29
• 3.2.13 差異片段的生物信息學(xué)分析29-30
• 4 結(jié)果與分析30-52
• 4.1 離體抗性鑒定30
• 4.2 侵染過(guò)程觀察30-32
• 4.2.1 芽管長(zhǎng)度30-31
• 4.2.2 乳突的形成31-32
• 4.3 RNA的提取32-33
• 4.4 PCR條件的優(yōu)化33-34
• 4.4.1 Taq DNA聚合酶33
• 4.4.2 退火溫度33-34
• 4.4.3 引物濃度34
• 4.5 DDRT-PCR34-37
• 4.6 差異片段序列測(cè)定37-41
• 4.7 差異片段的生物信息學(xué)分析41-52
• 4.7.1 差異片段B-1的生物信息學(xué)分析41-43
• 4.7.2 差異片段B-2的生物信息學(xué)分析43-46
• 4.7.3 差異片段B-3的生物信息學(xué)分析46-49
• 4.7.4 差異片段B-4的生物信息學(xué)分析49-52
• 5 討論52-55
• 6 總結(jié)55-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 致謝65

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