本文關(guān)鍵詞：大熊貓IFN-γ聚氰基丙烯酸正丁酯納米球的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大熊貓(Ailuropoda melanoleuca),我國特有珍稀野生動物,屬國家一級瀕危保護物種。隨著近年來圈養(yǎng)大熊貓的增多,增加了熊貓與人類“親密接觸”的機會,使得大熊貓疫病的流行背景變得愈加復(fù)雜,病毒性疾病發(fā)病率逐漸上升。干擾素γ(Interferon-gamma, IFN-γ)是細胞因子家族的重要成員,主要由自然殺傷細胞(NK細胞)和T細胞分泌,是Ⅱ型免疫干擾素的唯一成員。干擾素γ能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞、T/B細胞間的關(guān)系,增強免疫應(yīng)答,還具有抗病毒、抗腫瘤等多種生物學活性；廣泛應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防和治療。但其在體內(nèi)半衰期短、易發(fā)生酶解,需頻繁給藥。高分子納米載藥系統(tǒng)是近幾十年研發(fā)的新型給藥系統(tǒng),既可以增加藥物的穿透力、靶向性和穩(wěn)定性,又能保護蛋白類藥物免遭破壞,延長藥效。其中聚氰基丙烯酸正丁酯(Polybutylcyanoacrylate, PBCA)是一種極富潛力的納米載藥材料,擁有良好的生物相容性和可降解性,沒有免疫原性,安全性高。本試驗選取PBCA作為載體材料,大熊貓干擾素γ為藥物模型,制備納米球(IFNy-PBCA-NS),以期優(yōu)選出最佳的制作工藝,為進一步研究包封大熊貓多肽類藥物微粒提供參考依據(jù),為大熊貓疾病診療提供新的思路,主要結(jié)果如下：1.本試驗從刀豆凝集素A誘導(dǎo)的大熊貓外周血淋巴細胞中提取總RNA,成功擴增出大熊貓IFN-y基因。結(jié)果顯示所得IFN-y基因共465 bp,與GenBank中的大熊貓IFN-y基因相比較,匹配率達96%-99%,沒有缺失變異等情況。再將測序成功的產(chǎn)物連接到原核表達載體上,利用大腸桿菌系統(tǒng)進行培養(yǎng)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白約33.5 kD,主要以包涵體的形式存在。采用Ni柱親和層析柱純化蛋白,并梯度透析復(fù)性,經(jīng)核酸蛋白酶儀測定,蛋白濃度為0.46 mg/mL。采用VSV-WISH系統(tǒng)測定干擾素的抗病毒活性,結(jié)果為3.2×105U/mg。2.采用乳化聚合法制備IFNy-PBCA-NS結(jié)果顯示,所得納米球為骨架型納米球,經(jīng)電鏡觀察納米球外觀規(guī)整,粒徑在50 nm～200 nm之間,跨距0.55,大小較均勻,包封率為56.7%,載藥量為0.86%。在優(yōu)化納米球制備條件試驗中,確定pH值6-6.5、BCA用量5-10 g/L、poloxamer188用量5～10 g/L、IFN-γ用量小于0.8 g/L的條件范圍內(nèi)均有利于納米球的制備,不易出現(xiàn)粘連、分散不均等情況。小鼠藥效試驗結(jié)果表明,sc-IFNy-PBCA-NS組生命延長率(RLML)最顯著,IFNγ-PBCA-NS組整體效果優(yōu)于IFN-y組。SPSS軟件方差分析,可得ig-IFN-y組與ig-IFNy-PBCA組的RLML差異極顯著(P0.01)；sc-IFN-γ組與sc-IFNγ-PBCA組RLML差異顯著(P0.05)。說明包被后的IFN-γ在體內(nèi)抗病毒作用增強,采用PBCA為載藥材料制備的大熊貓IFN-γ納米球具有一定的緩釋作用。
【關(guān)鍵詞】：大熊貓 干擾素γ 原核表達 聚氰基丙烯酸正丁酯 納米球
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.79
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 符號說明8-12
• 第一章 文獻綜述12-27
• 1 大熊貓疾病研究概況12-13
• 1.1 病毒性疾病12-13
• 1.2 寄生蟲疾病13
• 2 干擾素研究概況13-21
• 2.1 干擾素的發(fā)現(xiàn)14
• 2.2 干擾素γ的產(chǎn)生與結(jié)構(gòu)14-15
• 2.3 干擾素γ的受體及信號傳導(dǎo)15-16
• 2.4 干擾素γ的主要生物活性16-19
• 2.4.1 抗病毒作用16-17
• 2.4.2 抗腫瘤作用17-18
• 2.4.3 免疫調(diào)節(jié)作用18
• 2.4.4 抗寄生蟲作用18-19
• 2.5 長效干擾素的研究情況19-21
• 2.5.1 PFG修飾19
• 2.5.2 定點突變技術(shù)19-20
• 2.5.3 糖基化修飾20
• 2.5.4 融合蛋白20
• 2.5.5 緩釋系統(tǒng)20-21
• 3 PBCA-NS載藥系統(tǒng)研究概況21-26
• 3.1 制作工藝22-23
• 3.1.1 乳化聚合法22
• 3.1.2 界面聚合法22-23
• 3.1.3 納米沉淀法23
• 3.1.4 嵌段共聚物合成法23
• 3.2 PBCA-NS載藥系統(tǒng)的應(yīng)用23-25
• 3.2.1 腦靶向性23-24
• 3.2.2 肝靶向性24
• 3.2.3 骨髓靶向性24-25
• 3.2.4 其他靶向性25
• 3.3 毒理學研究25-26
• 4 研究目的和意義26-27
• 第二章 IFNγ的原核表達27-47
• 1 實驗材料27-31
• 1.1 載體、菌株和細胞27-28
• 1.2 實驗動物28
• 1.3 實驗儀器28
• 1.4 試劑與配制28-31
• 2 實驗方法31-39
• 2.1 干擾素γ克隆載體的構(gòu)建31-35
• 2.1.1 引物的設(shè)計與合成31
• 2.1.2 大熊貓外周血淋巴細胞的分離31
• 2.1.3 總RNA的提取31-32
• 2.1.4 cDNA的合成32
• 2.1.5 目的基因的擴增與回收純化32-33
• 2.1.6 克隆載體的連接33
• 2.1.7 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化33-34
• 2.1.8 重組質(zhì)粒的鑒定34-35
• 2.2 干擾素γ原核表達載體的構(gòu)建35-39
• 2.2.1 表達載體的連接35
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化35
• 2.2.3 重組表達菌的誘導(dǎo)表達35-36
• 2.2.4 重組蛋白SDS-PAGE檢測36
• 2.2.5 原核表達的條件優(yōu)化36-37
• 2.2.6 重組蛋白可溶性檢測37
• 2.2.7 重組蛋白的純化37-38
• 2.2.8 重組蛋白的濃度與活性測定38
• 2.2.9 重組蛋白的免疫印跡(Western blotting)檢測38-39
• 3 結(jié)果與分析39-44
• 3.1 干擾素γ克隆載體的構(gòu)建39-40
• 3.1.1 目的基因的擴增39
• 3.1.2 重組質(zhì)粒的鑒定39-40
• 3.2 干擾素γ原核表達載體的構(gòu)建40-44
• 3.2.1 表達載體雙酶切鑒定40
• 3.2.2 重組蛋白SDS-PAGE檢測結(jié)果40-41
• 3.2.3 原核表達的條件優(yōu)化結(jié)果41-43
• 3.2.4 重組蛋白可溶性檢測結(jié)果43
• 3.2.5 重組蛋白的純化結(jié)果43-44
• 3.2.6 表達蛋白的濃度與活性結(jié)果44
• 3.2.7 表達蛋白的免疫印跡(Western blotting)檢測結(jié)果44
• 4 討論44-47
• 4.1 原核表達系統(tǒng)44-45
• 4.2 包涵體蛋白的純化與復(fù)性45-47
• 第三章 干擾素γ納米球的制備47-59
• 1 實驗材料47-48
• 1.1 病毒與細胞47
• 1.2 實驗動物47
• 1.3 實驗儀器47
• 1.4 試劑與配制47-48
• 2 實驗方法48-50
• 2.1 納米球的制備48
• 2.2 納米球的質(zhì)量評價48-49
• 2.2.1 納米球包封率、載藥量的測定48-49
• 2.2.2 納米球表征49
• 2.3 納米球的藥效測定49-50
• 3 結(jié)果與分析50-55
• 3.1 IFNγ-PBCA-NS的制備50-51
• 3.2 納米球的包封率與載藥量51-52
• 3.3 納米球的表征52-53
• 3.4 納米球藥效測定結(jié)果53-55
• 4 討論55-59
• 4.1 大熊貓IFN-γ納米球的制備情況55-56
• 4.2 納米球制備的影響因素56-57
• 4.2.1 pH值56
• 4.2.2 穩(wěn)定劑56-57
• 4.2.3 其他影響因素57
• 4.3 凍干保護劑57
• 4.4 納米球的表征57-58
• 4.5 納米球的藥效58-59
• 全文總結(jié)59-60
• 參考文獻60-65
• 致謝65-66
• 附件66

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本文編號：318951