本文關(guān)鍵詞：核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的比較研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種人畜共患傳染病,結(jié)核分枝桿菌是人和動物結(jié)核病的主要病原。人結(jié)核病和動物結(jié)核病是可以相互傳染的,人類的結(jié)核病可以通過呼吸或飛沫傳給人或其他動物,動物結(jié)核病除了通過呼吸或飛沫外,還可以通過一些動物產(chǎn)品如肉、奶、蛋等畜產(chǎn)品進(jìn)行傳播。目前,最為常見的動物結(jié)核就是牛結(jié)核病,它不僅給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的影響,并且給人類的健康安全也造成了很大的威脅。近年來,人結(jié)核病的發(fā)病率明顯上升,特別是兒童腸結(jié)核的發(fā)病率明顯增加,有報(bào)道顯示,從這些兒童患者中分離的30%的菌株為牛分枝桿菌。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段,同時(shí)也是確定結(jié)核病診斷、切斷傳播途徑并制定治療方案的重要依據(jù)。由于傳統(tǒng)的檢測方法不夠完善,如檢測時(shí)間長、靈敏性與特異性不高、對設(shè)備要求高等。因此,建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、價(jià)格低廉的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法對結(jié)核病控制有著極為重要的意義。目的:建立一種快速、準(zhǔn)確、價(jià)格低廉易于臨床推廣的,并可以運(yùn)用于畜產(chǎn)品中結(jié)核分枝桿菌檢測的方法。方法:通過優(yōu)化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)與RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)(Simultaneous amplification and testing,SAT)的反應(yīng)條件與體系,建立起兩種可以用于牛乳中結(jié)核分枝桿菌檢測的核酸擴(kuò)增方法。本實(shí)驗(yàn)通過對牛奶中結(jié)核分枝桿菌的DNA和RNA的提取方法以及對每種方法的反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,并對牛乳中結(jié)核分枝桿菌檢測的靈敏度、特異性、重復(fù)性進(jìn)行檢測,確定這兩種方法對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的最低檢測濃度(靈敏度)。同時(shí)還將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)同結(jié)核羅氏培養(yǎng)技術(shù)、抗酸染色鏡檢、PCR技術(shù)進(jìn)行比較,評價(jià)與分析各種檢測方法對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果,以確定最佳檢測方法,為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。結(jié)果:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)的靈敏度、特異性、重復(fù)性都比較高,對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的最低檢測濃度分別為3×101CFU/m L和3×100 CFU/m L。RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)的靈敏度要明顯高于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),并且是它的10倍。牛乳中結(jié)核分枝桿菌的DNA與RNA的提取方法分別為改良后的CTAB/NACL法與改良后的手工提取RNA法。結(jié)核培養(yǎng)技術(shù)、抗酸鏡檢、PCR技術(shù)對牛乳中結(jié)核分枝桿菌的檢測的最低濃度分別為3×105 CFU/m L、3×108 CFU/m L、3×104 CFU/m L。結(jié)論:建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)可用于牛乳中結(jié)核分枝桿菌的檢測,這兩種方法操作簡單,對實(shí)驗(yàn)儀器要求不高,易于在產(chǎn)品檢驗(yàn)與檢疫中應(yīng)用。與結(jié)核培養(yǎng)技術(shù)、抗酸涂片鏡檢技術(shù)、PCR技術(shù)相比,對牛乳中的結(jié)核分枝桿菌的檢測濃度更低,靈敏度更高,RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)的靈敏度要比環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)高10倍。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 16SRNA 牛奶 核酸恒溫?cái)U(kuò)增
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文縮略詞表13-14
• 前言14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-27
• 1 結(jié)核病的流行情況15-17
• 1.1 人結(jié)核病的流行情況與現(xiàn)狀15-16
• 1.2 牛結(jié)核病的流行現(xiàn)狀與趨勢16-17
• 2 結(jié)核病的發(fā)病率大幅上升的原因17-19
• 2.1 HIV與TB的雙重感染17-18
• 2.2 耐多藥結(jié)核分枝桿菌的散播18
• 2.3 BCG免疫效果降低18-19
• 2.4 人.的大規(guī)模流動19
• 2.5 診斷方法落后、耗費(fèi)大19
• 3 結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)19-27
• 3.1 細(xì)菌學(xué)診斷新技術(shù)19-21
• 3.1.1 以涂片為基礎(chǔ)的診斷技術(shù)19-20
• 3.1.2 以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的診斷新技術(shù)20-21
• 3.2 免疫學(xué)診斷21-23
• 3.2.1 結(jié)核菌素皮膚實(shí)驗(yàn)（TST）21
• 3.2.2 淋巴細(xì)胞分泌抗體的（ALS）檢測21-22
• 3.2.3 γ 干擾素檢測（IGRA）22
• 3.2.4 隱性結(jié)核感染的Quanti FERON血液學(xué)檢測22-23
• 3.2.5 ELISpot即酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法23
• 3.3 分子生物學(xué)診斷23-27
• 3.3.1 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）23
• 3.3.2 直接測序技術(shù)23
• 3.3.3 基因芯片技術(shù)23-24
• 3.3.4 Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)24
• 3.3.5 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)24
• 3.3.6 RNA擴(kuò)增技術(shù)24-27
• 第二章 實(shí)驗(yàn)部分27-60
• 實(shí)驗(yàn)一 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對結(jié)核分枝桿菌檢測條件的優(yōu)化27-36
• 摘要27
• 1 材料與方法27-30
• 1.1 材料27-28
• 1.1.1 菌株28
• 1.1.2 主要試劑28
• 1.2 方法28-30
• 1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)以及DNA模板的制備28
• 1.2.2 PCR檢測28
• 1.2.3 LAMP實(shí)驗(yàn)的引物28-29
• 1.2.4 LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件29
• 1.2.5 LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異性29
• 1.2.6 人工人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取方法比較29-30
• 1.2.7 LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌人工陽性乳的最低檢測濃度30
• 2 結(jié)果30-34
• 2.1 LAMP檢測方法的建立30
• 2.2 LAMP反應(yīng)體系與反應(yīng)程序的優(yōu)化30-31
• 2.3 LAMP擴(kuò)增技術(shù)靈敏度的檢測31
• 2.4 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)31-32
• 2.5 人工人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌DNA的提取32-33
• 2.6 人工人工陽性乳中LAMP的最低檢測濃度33-34
• 3 討論34-35
• 4 小結(jié)35-36
• 實(shí)驗(yàn)二 RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測技術(shù)檢測牛奶中結(jié)核分枝桿菌的研究36-50
• 摘要36
• 1 材料和方法36-42
• 1.1 材料36-39
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株36-37
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備37
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)重要試劑的配制37-39
• 1.2 方法39-42
• 1.2.1 無菌牛奶的制備39
• 1.2.2 結(jié)核分枝桿菌菌懸液的制備39
• 1.2.3 模板的制備39-40
• 1.2.4 SAT檢測40
• 1.2.5 SAT反應(yīng)體系的優(yōu)化40
• 1.2.6 SAT特異性、敏感性、重復(fù)性的檢測40-41
• 1.2.7 人工陽性乳的制備41
• 1.2.8 人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌總RNA提取41-42
• 1.2.9 SAT檢測結(jié)核分枝桿菌人工陽性乳特異性實(shí)驗(yàn)42
• 1.2.10 SAT檢測結(jié)核分枝桿菌人工陽性乳敏感性實(shí)驗(yàn)42
• 1.2.11 SAT檢測結(jié)核分枝桿菌人工陽性乳重復(fù)性實(shí)驗(yàn)42
• 2. 結(jié)果42-47
• 2.1 SAT檢測的優(yōu)化結(jié)果42
• 2.2 SAT特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-43
• 2.3 敏感性實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果43-44
• 2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果44
• 2.5 對人工陽性乳的檢測結(jié)果44-47
• 2.5.1 人工陽性乳模板的制備44-46
• 2.5.2 人工陽性乳模板SAT擴(kuò)增結(jié)果46
• 2.5.3 人工陽性乳的SAT特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-47
• 2.5.4 人工陽性乳的SAT敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果47
• 2.5.5 人工陽性乳的SAT重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果47
• 3 討論47-48
• 4 小結(jié)48-50
• 實(shí)驗(yàn)三 幾種不同檢測牛奶中結(jié)核分枝桿菌方法的比較50-60
• 摘要50
• 1 材料與方法50-53
• 1.1 材料50-51
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株50
• 1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備50-51
• 1.1.3 主要試劑的配制51
• 1.2 方法51-53
• 1.2.1 菌懸液的制備51-52
• 1.2.2 人工陽性乳的制備52
• 1.2.3 羅氏培養(yǎng)法檢測52
• 1.2.4 抗酸染色鏡檢52
• 1.2.5 PCR法檢測52-53
• 1.2.6 LAMP法檢測53
• 1.2.7 SAT法53
• 1.2.8 比較五種檢測方法檢測結(jié)果53
• 2 結(jié)果53-58
• 2.1 羅氏培養(yǎng)法檢測人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果53-54
• 2.2 抗酸染色鏡檢人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果54-55
• 2.3 PCR檢測人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果55
• 2.4 LAMP法擴(kuò)增檢測結(jié)核分枝桿菌人工陽性乳的結(jié)果55-56
• 2.5 SAT法檢測人工陽性乳中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果56-57
• 2.6 評價(jià)分析幾種檢測方法的結(jié)果57-58
• 3 討論58-59
• 4 小結(jié)59-60
• 創(chuàng)新點(diǎn)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 致謝67-68
• 作者簡介68-69
• 導(dǎo)師評閱表69

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王森;張文宏;;潛伏性結(jié)核感染的診治進(jìn)展[J];微生物與感染;2008年04期

2 姜世聞;胡屹;張慧;徐飚;;耐藥結(jié)核病的流行簡況[J];中國防癆雜志;2010年06期

3 李曉非;趙勤;汪亞玲;余文林;;兩種結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素定量檢測試劑盒檢測結(jié)核分枝桿菌感染結(jié)果比較研究[J];中國防癆雜志;2011年05期

4 宋紅煥;季明;唐國鋒;朱瑋;朱澄玉;陳誠;許衛(wèi)國;陸偉;;液基夾層杯技術(shù)用于基層實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病診斷的可行性研究[J];中國防癆雜志;2012年07期

5 王正榮;陳創(chuàng)夫;楊明鋒;孟茹;曹旭東;張輝;喬軍;;結(jié)核桿菌多位點(diǎn)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年04期

6 李拯民,王u&民;耐藥結(jié)核病的流行趨勢[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2000年02期

7 劉永生;丁耀忠;張杰;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)的應(yīng)用研究[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2010年08期

8 周祖模;金嘉琳;王森;黃河清;石勇明;陳林;張文宏;翁心華;;全血γ干擾素釋放試驗(yàn)在活動性肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版);2012年06期

9 趙冰;宋媛媛;逄宇;李強(qiáng);歐喜超;夏輝;趙雁林;;中國耐多藥結(jié)核分枝桿菌二線抗結(jié)核藥物敏感性分析[J];中國防癆雜志;2013年10期

10 程義娥;;淺談精神病院預(yù)防結(jié)核病發(fā)生的措施[J];中國實(shí)用醫(yī)藥;2013年31期

  本文關(guān)鍵詞：核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的比較研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：316827