本文關(guān)鍵詞：MP1基因在遼寧絨山羊皮膚的表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遼寧絨山羊是我國特有的品種,并且是禁止基因外流的寶貴資源,其羊絨產(chǎn)量居全國首位,因此,研究與羊絨相關(guān)基因的功能就更具實(shí)際生產(chǎn)意義。前期,我們實(shí)驗(yàn)室通過建庫、測(cè)通獲得了遼寧絨山羊的新基因MP1(MEK Partner 1)的全長序列,首先對(duì)MP1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,檢測(cè)其核酸及氨基酸的同源性,建立進(jìn)化樹等。然后通過RT-PCR檢測(cè)MP1基因在各組織中的表達(dá),再利用qPCR方法檢測(cè)其在毛囊生長的不同時(shí)期的初、次級(jí)毛囊中的表達(dá)含量,最后對(duì)絨山羊興盛期皮膚進(jìn)行原位雜交并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)位點(diǎn)分析。為進(jìn)一步研究MP1基因是否與羊絨細(xì)度之間存在某種關(guān)系,利用本實(shí)驗(yàn)室已有的Noggin基因RNA干擾的慢病毒,感染遼寧絨山羊皮膚細(xì)胞后,再利用qPCR檢測(cè)其對(duì)MP1基因表達(dá)的影響,為培育出具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的絨山羊提供一定的分子理論基礎(chǔ)。結(jié)果如下:(1)MP1基因編碼的蛋白質(zhì)包含124個(gè)氨基酸,分子量為13.64 KD,是一個(gè)疏水性蛋白。MP1含有α螺旋結(jié)構(gòu)(25.81%)、延伸鏈結(jié)構(gòu)(33.87%)和無規(guī)卷曲(40.32%)。無跨膜結(jié)構(gòu)域,無信號(hào)肽。MPl的氨基酸序列包含一個(gè)保守的MAPKKl-Int結(jié)構(gòu)域,含有有3個(gè)可能成為磷酸化位點(diǎn)的Ser。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:僅在皮膚、心臟中MP1基因有表達(dá),而在肝、腎、肺、脾中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)。qPCR檢測(cè)毛囊在興盛期時(shí),MP1基因在次級(jí)毛囊的表達(dá)量為初級(jí)毛囊的1.65倍,退行期MP1基因在次級(jí)毛囊的表達(dá)量為初級(jí)毛囊的3.25倍。原位雜交分析發(fā)現(xiàn):MP1在內(nèi)根鞘上有明顯的表達(dá),在毛干、外根鞘以及毛囊乳突中無表達(dá)。(2)成功構(gòu)建出Noggin基因RNAi的慢病毒載體,Noggin基因被干擾后,qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MP1基因起負(fù)調(diào)控作用,MP1基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。由以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論:(1)通過對(duì)MP1基因在生物信息學(xué),熒光定量以及原位雜交等方面的研究,推測(cè)MP1對(duì)絨山羊皮膚細(xì)胞的生長發(fā)育產(chǎn)生影響,可能與毛囊的生成及再上皮化過程有關(guān),且并具有能夠使羊毛變細(xì)的作用。(2)推測(cè)MP1基因可能存在于Noggin基因表達(dá)調(diào)控的下游,并通過其與Noggin基因之間存在的某種關(guān)系,實(shí)現(xiàn)BMP-MAPK途徑共同作用來調(diào)節(jié)絨山羊的表皮及毛囊的的穩(wěn)態(tài)和發(fā)育過程。
【關(guān)鍵詞】：遼寧絨山羊 MP1 熒光定量 原位雜交 RNAi 慢病毒
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 引言9
• 1 實(shí)驗(yàn)背景介紹9-15
• 1.1 遼寧絨山羊9
• 1.2 MP1基因及其研究進(jìn)展9-11
• 1.2.1 MAPK信號(hào)通路及支架蛋白9-10
• 1.2.2 MP1基因10-11
• 1.3 RNA干擾技術(shù)11-12
• 1.3.1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)11-12
• 1.3.2 RNAi的作用機(jī)制12
• 1.3.3 RNAi載體的選擇與應(yīng)用12
• 1.3.4 RNAi的應(yīng)用12
• 1.4 研究的目的及意義12-13
• 1.5 研究技術(shù)路線13-14
• 1.6 本研究項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新14-15
• 1.6.1 特色14
• 1.6.2 創(chuàng)新14-15
• 2 MP1基因在毛囊生長不同時(shí)期的表達(dá)分析15-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及樣本采集15-16
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備15
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材15
• 2.1.3 樣本的采集15-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-22
• 2.2.1 MP1基因全長測(cè)通16
• 2.2.2 生物信息學(xué)分析16-17
• 2.2.3 初、次級(jí)毛囊的分離17
• 2.2.4 初次級(jí)毛囊總RNA的提取17-18
• 2.2.5 總RNA的檢測(cè)18
• 2.2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA18-19
• 2.2.7 RT-PCR檢測(cè)19-20
• 2.2.8 qPCR檢測(cè)20
• 2.2.9 原位雜交20-22
• 2.3 結(jié)果22-33
• 2.3.1 MP1基因的生物信息學(xué)分析22-30
• 2.3.2 RNA提取30-31
• 2.3.3 qPCR31-32
• 2.3.4 原位雜交32-33
• 2.4 討論33-35
• 3 慢病毒感染后MP1基因的表達(dá)研究35-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞及病毒液35
• 3.1.2 主要試劑、儀器與耗材35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 3.2.1 遼寧絨山羊的原代皮膚細(xì)胞培養(yǎng)35
• 3.2.2 Noggin基因干擾慢病毒及陰性病毒感染羊皮膚細(xì)胞35-36
• 3.2.3 提取病毒感染后的細(xì)胞中的總RNA36
• 3.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA36
• 3.2.5 Lenti-EGFP-Noggin-miR慢病毒感染羊皮膚細(xì)胞后MP1基因的qPCR檢測(cè)36-38
• 3.3 結(jié)果38-41
• 3.3.1 感染病毒前，正常皮膚細(xì)胞的鏡檢照片38
• 3.3.2 慢病毒感染靶細(xì)胞（感染48小時(shí)后）38-39
• 3.3.3 RNA抽提電泳圖39-40
• 3.3.4 Lenti- Noggin-EGFP-miR慢病毒感染羊皮膚細(xì)胞后MP1基因的qPCR檢測(cè)40-41
• 3.4 討論41-43
• 4 注意事項(xiàng)43-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 附錄A MP1基因的開放閱讀框49-50
• 附錄B MP1基因在各個(gè)時(shí)期初次級(jí)毛囊中熒光定量的擴(kuò)增曲線及溶解曲線50-53
• 附錄C 病毒液感染后qPCR檢測(cè)的各組擴(kuò)增曲線及溶解曲線53-54
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文與獲獎(jiǎng)情況54-55
• 致謝55

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