由于哺乳動(dòng)物體內(nèi)缺乏有n-3多不飽和脂肪酸脫氫酶,不能自身合成n-3多不飽和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFA）,人們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源的fat-1基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi),從而獲得內(nèi)源性n-3 PUFA增多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本試驗(yàn)對(duì)fat-1轉(zhuǎn)基因牛（FT組）和野生型牛（WT組）的胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化組學(xué)分析,并通過(guò)ELISA的方法驗(yàn)證了細(xì)胞線粒體能量代謝關(guān)鍵調(diào)控因子的變化。與對(duì)照組相比,FT牛的細(xì)胞全基因組mRNA表達(dá)和DNA甲基化程度均發(fā)生變化,轉(zhuǎn)錄組差異基因富集到與能量代謝和甲基化相關(guān)通路,而能量代謝相關(guān)通路也在DNA甲基化測(cè)序中被富集。對(duì)能量代謝相關(guān)限速酶及產(chǎn)物進(jìn)行活性和表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),n-3 PUFA含量增加,在一定程度上抑制脂肪合成,提高脂肪酸合成效率,促進(jìn)脂肪酸β氧化;降低糖酵解中HK、PFK和PK的活性,抑制糖酵解過(guò)程;并且通過(guò)降低IDH的活性,減弱TCA能力。分析還發(fā)現(xiàn),高水平的n-3 PUFA降低NADH-輔酶Q還原酶、細(xì)胞色素C氧化酶和ATP合酶的活力,顯著降低ATP含量,抑制線粒體氧化磷酸化過(guò)程。與... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

脂肪酸的分類

內(nèi)蒙古大學(xué)碩士論文14圖2.1一般的多不飽和脂肪酸生物合成途徑。哺乳動(dòng)物的酶由黑色實(shí)心反應(yīng)箭頭繪制。盡管對(duì)于哺乳動(dòng)物和秀麗隱桿線蟲而言，這都是保守的途徑，但線蟲擁有紅色的實(shí)心紅色箭頭Δ12和omega-3去飽和酶。與哺乳動(dòng)物不同，秀麗隱桿線蟲不合成22個(gè)碳的PUFA。縮寫：AA，花生四烯酸；ACC，乙酰輔酶A羧化酶；ACP，酰基載體蛋白；AdA，二十二碳四烯酸；ALA，α-亞麻酸；cVA，順式-庚酸；DGLA，二高-γ-亞麻酸；DPA，二十二碳五烯酸；EPA，二十碳五烯酸；ETA，二十碳四烯酸；FAS，脂肪酸合酶；GLA，γ-亞麻酸；LA，亞麻酸；OL，油酸；PAL，棕櫚酸；POA，棕櫚油酸；SDA，硬脂酸；STE，硬脂酸；THA，四二十碳六烯酸（乳酸），TPA，四二十碳五烯酸[147]。Fig.2.1Thegeneralpolyunsaturatedfattyacidsbiosynthesispathway.Mammalianenzymesaredrawnbysolidblackreactionarrows.AlthoughthisisaconservedpathwayforbothmammalsandC.elegans,thenematodespossessΔ12andomega-3desaturaseenzymesthataresolidredarrows.Unlikemammals,C.elegansdonotsynthesizethe22carbonPUFAs.Abbreviations:AA,arachidonicacid;ACC,acetyl-CoAcarboxylase;ACP,acylcarrierproteins;Ada,docosatetraenoicacid;ALA,α-linolenicacid;cVA,cis-vaccenicacid;DGLA,dihomo-γ-linolenicacid;DPA,docosapentaenoicacid;EPA,eicosapentaenoicacid;ETA,eicosatetraenoicacid;FAS,fattyacidsynthase;GLA,γ-linolenicacid;LA,linolenicacid;OL,oleicacid;PAL,palmiticacid;POA,palmitoleicacid;SDA,stearidonicacid;STE,stearicacid;THA,tetracosahexaenoicacid(nisinicacid),TPA,tetracosapentaenoicacid[147].鑒于n-3PUFA對(duì)機(jī)體健康及發(fā)育有重要作用，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源fat-1

N-3PUFA通過(guò)DNA甲基化調(diào)控FAT-1轉(zhuǎn)基因牛成纖維細(xì)胞線粒體能量代謝19圖2.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析流程Fig.2.1TheanalysisplanofRNA-Seq2.3.3DNA甲基化測(cè)序DNA準(zhǔn)備(1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；(2)用胰酶消化并收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到2ml旋蓋尖底離心管（DNasefree）；(3)25℃離心1000rpm，5min，得到細(xì)胞沉淀，去上清（胰酶）；(4)用1mlPBS（DNasefree，室溫）清洗一次。25℃離心1000rpm，5min得到細(xì)胞沉淀，棄上清；(5)置于-80℃冰箱或液氮中長(zhǎng)期保存；(6)運(yùn)輸方式：干冰運(yùn)輸。測(cè)序公司（聯(lián)川生物）使用QIAampFastDNA組織試劑盒（Qiagen,Dusseldorf,Germany）提取總DNA。用分光光度計(jì)讀取A260/280比值測(cè)定DNA含量。當(dāng)A260/280比值在1.8-2.0時(shí)，DNA是可用的。對(duì)超聲破碎后的DNA樣品進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。利用Accel-NGSMethyl-SeqDNALibraryKit（SWIFT，MI，USA）將接頭連接到單鏈DNA片段上。測(cè)序及數(shù)據(jù)分析使用LCSciences的IlluminaHiSeq4000平臺(tái)上進(jìn)行了2×150bp的雙端測(cè)序。數(shù)據(jù)分析流程如Fig.2.2：


本文編號(hào)：3122464