本文關(guān)鍵詞：矮牽牛PhIDL基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：器官脫落(organ abscission)是指植物體的部分器官(花、葉、果等)脫離母體的生理過程。脫落一般發(fā)生在一個(gè)可預(yù)知的、由特殊形態(tài)細(xì)胞組成的部位—離區(qū)(abscission zone)。.離區(qū)的激活一直都是植物器官脫落研究的焦點(diǎn),IDA基因是離區(qū)激活的必需基因。目前在擬南芥中已經(jīng)明確的花器官脫落信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是Bopl/Bop2→IDA →HAE/HSL2→MKK4/MKK5→MAPK→花器官脫落。IDA基因已經(jīng)在擬南芥、番茄、煙草、大豆進(jìn)行了克隆和相應(yīng)的功能研究,但在矮牽牛中還未見報(bào)道。本研究成功從矮牽�；ㄖ蟹蛛x克隆出了IDA基因,命名為PhIDL,主要結(jié)果如下：1. 利用EST數(shù)據(jù)庫中矮牽牛的已知的序列設(shè)計(jì)引物,通過反轉(zhuǎn)錄分離克隆了PhIDL基因,PhIDL基因全長為381 bp.其中包括一個(gè)完整的開放閱讀框?yàn)?70 bp,編碼89個(gè)氨基酸,全長序列還包括5’非編碼區(qū)(5'UTR)長度15 bp,3’非編碼區(qū)(3'UTR)長度為94 bp。NCBI庫中的氨基酸序列,經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)：該序列與茄科煙草(Nicotiana tomentosiformis) 、番茄(Solarium lycopersicum) 、大豆(Glycine max)和毛果楊(Populus trichocarpa)的同源性分別為62%、49%、40%、42%,且氨基酸長度相似。2.PhIDL蛋白分子式為C436H681N111O127S10,該蛋白質(zhì)的理論分子量為9830.4,等電點(diǎn)(pI)為8.8,總平均疏水指數(shù)(GRAVY)為-0.199,不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)為59.05,推測(cè)該蛋白質(zhì)是一個(gè)不穩(wěn)定的蛋白。該蛋白疏水性最大值約為2.8(第24個(gè)氨基酸),最小值約為-2.411(第58個(gè)氨基酸),其中第15-35位氨基酸區(qū)域的疏水區(qū)域比較明顯。在第15-34位氨基酸處,該蛋白有一個(gè)跨膜區(qū),與疏水性區(qū)域相稱。該蛋白的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核內(nèi)(nuclear) 。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明含32.58%α螺旋,15.73%p折疊,6.74%p轉(zhuǎn)角,44.94%的無規(guī)則卷曲,是一種混合型蛋白。該蛋白不存在信號(hào)肽,為非分泌性蛋白；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明PhIDL具有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)。3.成功構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體PhIDL-p2355,用凍融法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101菌株,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化野生型煙草和擬南芥。經(jīng)卡那(Kana)抗性篩選和PCR檢測(cè),已經(jīng)成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【關(guān)鍵詞】：矮牽牛 器官脫落 基因克隆 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S681.9
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文縮寫表7-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-17
• 1.1 脫落概述10
• 1.2 花器官脫落過程研究進(jìn)展10-16
• 1.2.1 離區(qū)的分化10-12
• 1.2.2 離區(qū)的激活及相關(guān)基因的研究12-15
• 1.2.3 離區(qū)細(xì)胞的分離及保護(hù)層的形成15-16
• 1.3 研究的目的、意義16-17
• 2 PhIDL基因的克隆及生物信息學(xué)分析17-33
• 2.1 材料與方法17-22
• 2.1.1 植物材料、主要試劑及儀器設(shè)備17-18
• 2.1.2 方法18-22
• 2.2 結(jié)果與分析22-33
• 2.2.1 矮牽�；≧NA的質(zhì)量檢測(cè)22-23
• 2.2.2 PhIDL基因全長的克隆23-24
• 2.2.3 矮牽牛PhIDL基因的生物信息學(xué)分析24-33
• 3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PhIDL對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化33-44
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑33-34
• 3.2 儀器設(shè)備：同2.1.134
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法34-39
• 3.3.1 矮牽牛PhIDL基因植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建34-36
• 3.3.2 CaCl_2法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)36
• 3.3.3 植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒PhIDL-p2355凍融法轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞36-37
• 3.3.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PhIDL基因轉(zhuǎn)化煙草37-39
• 3.4 結(jié)果與分析39-44
• 3.4.1 矮牽牛PhIDL基因植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建39-41
• 3.4.2 植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒PhIDL-p2355轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌41-42
• 3.4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PhIDL基因轉(zhuǎn)入煙草42-43
• 3.4.4 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)43-44
• 4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PhIDL對(duì)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化(蘸花法)44-48
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法44-46
• 4.2.1 擬南芥種植44-45
• 4.2.2 擬南芥蘸花45
• 4.2.3 抗性篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥植株45-46
• 4.3 結(jié)果與分析46-48
• 4.3.1 擬南芥的蘸花與篩選抗性植株46-47
• 4.3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR檢測(cè)47-48
• 5 討論與結(jié)論48-51
• 5.1 矮牽牛PhIDL基因的克隆48
• 5.2 矮牽牛PhIDL基因的序列特征及所編碼的蛋白質(zhì)基本性質(zhì)48-49
• 5.3 PhIDL基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化49-50
• 5.4 PhIDL基因?qū)M南芥的遺傳轉(zhuǎn)化50-51
• 6 研究展望51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57

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