本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達αvβ3細胞系的建立及其對口蹄疫病毒易感性的評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是單股正鏈RNA病毒,屬于微RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員,FMDV對偶蹄動物高度致病,包括牛、水牛、豬、山羊、綿羊及多種野生物種。病毒識別受體是病毒感染的第一步,決定著病毒感染細胞的類型和宿主嗜性。FMDV可以識別不同受體,然后介導(dǎo)不同的路徑進入細胞。FMDV通過識別位點RGD結(jié)合整聯(lián)蛋白受體(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)后,通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞路徑進入細胞;FMDV還可以同VP3第56位精氨酸(VP3056R)結(jié)合硫酸乙酰肝素受體,通過小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞路徑進入細胞。整聯(lián)蛋白受體除了介導(dǎo)病毒感染作用外,還具有介導(dǎo)或激發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種作用,這些功能參與病毒的致病機制還不清楚。因此,本研究為了揭示單個受體對病毒感染和信號介導(dǎo)的作用,構(gòu)建單個受體細胞系,為進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。本研究克隆了整聯(lián)蛋白受體αvβ3基因,并構(gòu)建了穩(wěn)定表達αvβ3的CHO-677-αvβ3細胞系,并評價了對口蹄疫病毒的易感性,具體內(nèi)容如下:(1)αv和β3亞基的克隆:從乳鼠肺組織中分別提取了整聯(lián)蛋白受體αv和β3亞基基因組總RNA,根據(jù)GenBank中已公布的整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因序列,分別設(shè)計合成兩對特異性引物,RT-PCR擴增出鼠源整聯(lián)蛋白αv和β3亞基基因,產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后分別與p GEM-T載體相連,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并進行多序列比對分析。結(jié)果表明,鼠源整聯(lián)蛋白αv亞基基因全長3135bp,編碼1045個氨基酸,β3亞基基因全長2364bp,編碼788個氨基酸。序列同源性比較發(fā)現(xiàn),鼠源αv亞基基因與人、豬同源性較高,而β3亞基基因與牛和綿羊的同源性較高。(2)αv和β3蛋白表達及其多抗的制備:將擴增的αv和β3部分胞外域基因分別與原核表達載體pET-30a相連,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒,測序確認(rèn)讀碼框正確后,將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)表達重組融合蛋白。通過SDS-PAGE鑒定后提取包涵體,以電泳分離純化的重組融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,以Western blot鑒定血清特異性。結(jié)果顯示,實現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中的高效表達,SDS-PAGE顯示分子量分別為40 kDa和40 k Da,主要以包涵體形式存在于菌體中,該血清可與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。(3)穩(wěn)定表達αvβ3細胞系建立:用高效慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),構(gòu)建了穩(wěn)定表達αvβ3異二聚體的CHO-677細胞系,用PCR和IFA分別從基因和蛋白水平檢測了第二十代細胞系中αv和β3亞基的表達,表明該基因已經(jīng)成功的導(dǎo)入CHO-677細胞并穩(wěn)定表達。(4)對口蹄疫病毒易感性的評價:為了評價該細胞系對口蹄疫病毒易感性,用蝕斑實驗、TCID50、實時熒光定量和間接免疫熒光實驗比較分析口蹄疫病毒在細胞系和親本細胞上的生物學(xué)特性差異,結(jié)果表明感染FMDV/O/ZK/93之后,與親本細胞相比,CHO-677-αvβ3細胞系上病毒RNA水平和蛋白表達量顯著提高。數(shù)據(jù)表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達αvβ3的細胞系,并可增加對口蹄疫病毒的易感性。
【關(guān)鍵詞】：口蹄疫病毒 整聯(lián)蛋白 αvβ3 CHO-677細胞系
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 英文縮略表11-12
• 第一章 引言12-21
• 1.1 研究背景、目的和意義12
• 1.2.蹄疫概述12-14
• 1.2.1.蹄疫病毒分離及病毒亞型特性13-14
• 1.2.2.蹄疫病毒基因組及結(jié)構(gòu)14
• 1.3.蹄疫病毒受體研究進展14-19
• 1.3.1.蹄疫病毒 αvβ3 整聯(lián)蛋白受體15-16
• 1.3.2.蹄疫病毒 αvβ6 整聯(lián)蛋白受體16-17
• 1.3.3.蹄疫病毒 αvβ1 整聯(lián)蛋白受體17-18
• 1.3.4.蹄疫病毒 αvβ8 整聯(lián)蛋白受體18
• 1.3.5.蹄疫病毒硫酸乙酰肝素（HS）受體18
• 1.3.6.蹄疫病毒新受體18-19
• 1.4 整聯(lián)蛋白 αvβ3 功能研究進展19-21
• 1.4.1 介導(dǎo)血管生成19
• 1.4.2 介導(dǎo)腫瘤生長19-20
• 1.4.3 介導(dǎo)細胞凋亡20
• 1.4.4 介導(dǎo)細胞粘附20-21
• 第二章 .蹄疫病毒鼠源整聯(lián)蛋白受體 αv和 β3 基因的克隆及分析21-29
• 2.1 材料與方法21-25
• 2.1.1 試驗材料21
• 2.1.2 主要試劑及配制21-22
• 2.1.3 試驗器材22
• 2.1.4 試驗方法22-25
• 2.2 結(jié)果25-27
• 2.2.1 鼠源整聯(lián)蛋白 αv和 β3 亞基基因PCR擴增25-26
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定26-27
• 2.2.3 基因序列分析27
• 2.3 討論27-29
• 第三章 鼠源 αv和 β3 基因的原核表達及其多克隆抗體的制備29-37
• 3.1 材料與方法29-32
• 3.1.1 實驗材料29
• 3.1.2 實驗方法29-32
• 3.2 結(jié)果32-35
• 3.2.1 目的片段擴增32
• 3.2.2 重組表達質(zhì)粒的鑒定32-33
• 3.2.3 誘導(dǎo)表達重組菌33-34
• 3.2.4 可溶性分析34
• 3.2.5 純化重組蛋白34-35
• 3.2.6 鑒定多克隆抗體35
• 3.3 討論35-37
• 第四章 鼠源整聯(lián)蛋白CHO677αvβ3 細胞系的建立及鑒定37-44
• 4.1 材料與方法37-40
• 4.1.1 實驗材料37
• 4.1.2 主要試劑37-38
• 4.1.3 試驗方法38-40
• 4.2 結(jié)果40-42
• 4.2.1 慢病毒雙表達載體的鑒定40
• 4.2.2 細胞系的鑒定40-41
• 4.2.3 病毒感染試驗結(jié)果41-42
• 4.2.4 抗體阻斷試驗結(jié)果42
• 4.3 討論42-44
• 第五章 全文結(jié)論44-45
• 參考文獻45-52
• 附錄52-56
• 致謝56-57
• 作者簡歷57

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張華;澳大利亞嚴(yán)防口蹄疫的入侵[J];全球科技經(jīng)濟w

本文編號：305957