本文關(guān)鍵詞：miRNA-101a對(duì)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化調(diào)控作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：MicroRNAs (miRNAs)可以參與調(diào)控胚胎早期發(fā)育,細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,腫瘤發(fā)生及脂類代謝等許多復(fù)雜的生物過(guò)程,且miRNA在生物體內(nèi)的表達(dá)具有時(shí)空特異性。已有研究表明miRNA-101a (miR-101a)參與了細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程的調(diào)控,但關(guān)于miR-101a對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究擴(kuò)增了山羊miR-101a的前體及側(cè)翼序列,分析了miR-101a的組織表達(dá)及其對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SMSC)增殖、分化的影響。利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證了肌肉分化抑制基因EZH2與niR-101a結(jié)合的靶位點(diǎn),并檢測(cè)了過(guò)表達(dá)或抑制miR-101a對(duì)靶基因EZH2 mRNA表達(dá)水平的影響,初步揭示了miR-101a可能通過(guò)抑制靶基因的蛋白表達(dá)調(diào)控骨骼肌發(fā)育的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下：1.山羊miR-101la的前體及側(cè)翼序列448 bp,且成熟miR-101a在不同物種中序列高度保守,通過(guò)RNAfold軟件在線分析表明山羊miR-101a前體符合microRNA結(jié)構(gòu)特征。半定量PCR和熒光定量PCR (RT-qPCR)結(jié)果顯示]miR-101a在臂三頭肌、背最長(zhǎng)肌、半膜肌和腰大肌等肌肉組織中的表達(dá)量高于心、肝、脾、肺和腎等其他5個(gè)內(nèi)臟組織。2. RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示Pax7 mRNA在體外培養(yǎng)的SMSC增殖階段表達(dá)量高,分化過(guò)程中表達(dá)量顯著下降(P0.05); MyoD在增殖及分化初期表達(dá)量高；MyoG在分化融合的第三天表達(dá)量最高；而MyHC在分化融合過(guò)程中表達(dá)量逐漸升高。RT-qPCR檢測(cè)miR-101a在SMSC分化0d、1d、3d、5d、7d的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)miR-101a在SMSC分化過(guò)程中表達(dá)量隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加(P0.05)。3.過(guò)表達(dá)或抑制miR-101a后誘導(dǎo)SMSC分化48 h,熒光定量PCR檢測(cè)肌肉標(biāo)志基因Pax7、MyoD、MyoG、MyHC mRNA的表達(dá)變化,結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)miR-101a后,與對(duì)照組相比MyoG和MyHC基因表達(dá)量顯著提高(P0.01), Pax7和MyoD基因表達(dá)量顯著下降(P0.05)；抑制miR-101a后MyoG(P0.01)和MyHC(P0.05)基因表達(dá)量顯著下降,Pax7(P0.01)和MyoD(P0.05)基因表達(dá)量顯著增加,上述結(jié)果表明miR-101a能促進(jìn)SMSC的分化。4.過(guò)表達(dá)或抑制miR-101a后應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)試劑分析miR-101a對(duì)SMSC增殖的影響,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)或抑制miR-101a與NC對(duì)照組相比對(duì)細(xì)胞增殖的影響不顯著(P0.05)。5.選用PicTar、TargetScan和miRanda軟件預(yù)測(cè)miR-101a的靶基因,篩選出候選靶基因EZH2(肌細(xì)胞分化抑制基因),成功構(gòu)建PGL3-Control-EZH2報(bào)告載體。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證了靶EZH2的3'-UTR區(qū)含有與miR-101a作用的靶位點(diǎn)。6. RT-qPCR檢測(cè)在SMSC分化Od、1d、3d、5d和7d靶基因EZH2 mRNA的表達(dá)水平,及過(guò)表達(dá)或抑制miR-101a誘導(dǎo)SMSC分化48 h后,EZH2 mRNA的表達(dá)量,結(jié)果顯示：靶基因EZH2在細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)量下調(diào),而過(guò)表達(dá)或抑制miR-101a后,與對(duì)照組相比EZH2 mRNA表達(dá)量變化不顯著(P0.05),表明miR-101a可能是通過(guò)調(diào)控靶基因EZH2的蛋白水平來(lái)促進(jìn)骨骼肌分化的。
【關(guān)鍵詞】：miRNA-101a 山羊 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化 EZ
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-21
• 1.1 肌肉形成概述12-15
• 1.1.1 骨骼肌發(fā)生和發(fā)育12-13
• 1.1.2 骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子13-15
• 1.2 MicroRNA15-18
• 1.2.1 MicroRNA定義及產(chǎn)生機(jī)制15-16
• 1.2.2 MicroRNA作用機(jī)理16
• 1.2.3 MicroRNA與small interfering RNA的區(qū)別16-17
• 1.2.4 MicroRNA的檢測(cè)方法17-18
• 1.2.5 MicroRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)及鑒定18
• 1.3 參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育的microRNAs18-20
• 1.4 miRNA-101a的研究進(jìn)展20-21
• 1.5 本研究的目的和意義21
• 2 材料與方法21-37
• 2.1 試驗(yàn)材料21-28
• 2.1.1 山羊組織及血液樣品21
• 2.1.2 菌株、細(xì)胞和載體21-23
• 2.1.3 主要試劑23-24
• 2.1.4 主要試劑的配制24-26
• 2.1.5 主要儀器26
• 2.1.6 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)26-28
• 2.2 試驗(yàn)方法28-37
• 2.2.1 技術(shù)路線28-29
• 2.2.2 山羊miR-101a前體及側(cè)翼序列的擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析29
• 2.2.3 miR-101a在山羊不同組織的表達(dá)規(guī)律分析29-31
• 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)31-32
• 2.2.5 SMSCs的HE染色及融合率的評(píng)估32
• 2.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染32-33
• 2.2.7 細(xì)胞增殖試驗(yàn)33
• 2.2.8 miRNA及肌細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)量分析試驗(yàn)33-36
• 2.2.9 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)36-37
• 3 結(jié)果與分析37-51
• 3.1 山羊miR-101a的克隆及結(jié)構(gòu)分析37-39
• 3.1.1 miR-101a的克隆及測(cè)序37-38
• 3.1.2 山羊miR-101a的結(jié)構(gòu)分析38-39
• 3.2 miR-101a在山羊不同組織間的表達(dá)譜39-40
• 3.3 SMSC分化模型的建立40-42
• 3.4 SMSC分化過(guò)程中miR-101a的表達(dá)42
• 3.5 miR-101a對(duì)SMSC分化的影響42-45
• 3.5.1 轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)42-43
• 3.5.2 過(guò)表達(dá)miR-101a促進(jìn)SMSC分化43-44
• 3.5.3 抑制miR-101a阻礙SMSC分化44-45
• 3.6 miR-101a對(duì)SMSC增殖的影響45-47
• 3.6.1 過(guò)表達(dá)miR-101a對(duì)SMSC增殖的影響46
• 3.6.2 抑制miR-101a對(duì)SMSC增殖的影響46-47
• 3.7 miR-101a靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果47-48
• 3.8 miR-101a靶基因EZH2的載體構(gòu)建與測(cè)序48-49
• 3.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-101a靶標(biāo)基因EZH249-50
• 3.10 miR-101a對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)源性EZH2的調(diào)控50-51
• 4 討論51-56
• 4.1 MicroRNA的表達(dá)及檢測(cè)51-52
• 4.2 MicroRNA對(duì)細(xì)胞分化的影響52-54
• 4.3 MicroRNA mimic或inhibitor的使用54
• 4.4 MicroRNA靶基因的鑒定54-56
• 5 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄65-66
• 致謝66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李丹丹;miRNA-101a對(duì)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化調(diào)控作用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：miRNA-101a對(duì)山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化調(diào)控作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：297209