本文關(guān)鍵詞：氨基脲對斑馬魚（Danio rerio）的抗雌激素效應(yīng)機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,新型污染物氨基脲(semicarbazide,SEM)主要存在于嬰兒食品、果汁、果醬、蜜餞等日常食品中,而在液體牛奶、面粉等食品中也檢出氨基脲殘留。2009年9月我國東營潮河入�？诩班徑Ｓ蚝Ｋ陌被搴扛哌_46.41 μg/L,貝類等生物體內(nèi)氨基脲平均含量為3.14-6.46μg/kg,超過歐盟對動物源性食品中氨基脲殘留的限量值1.0μg/kg.由此可見,氨基脲不但威脅人類的食品安全,也對我國海洋生態(tài)環(huán)境造成了嚴重危害。已有的研究發(fā)現(xiàn),氨基脲在哺乳動物和魚體內(nèi)發(fā)揮潛在的抗雌激素效應(yīng),例如降低雌性大鼠血漿E2水平,抑制雌性斑馬魚肝臟中雌激素受體(estrogen receptor α,ERα)基因和卵黃原蛋白1 (vitellogenin-1,vtg-1)基因的表達,但是氨基脲發(fā)揮以上抗雌激素效應(yīng)的機制尚不明確。因此,本文采用氨基脲暴露性成熟的成年斑馬魚,以斑馬魚性腺組織性激素含量為指標,明確氨基脲在成年斑馬魚體內(nèi)是否通過拮抗17p-雌二醇(17β-estradiol,E2)水平發(fā)揮抗雌激素效應(yīng)；其次在類固醇合成酶的基因表達水平以及下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonad axis,HPG軸)對E2的調(diào)控兩方面從E2合成的角度探究氨基脲對斑馬魚的抗雌激素效應(yīng)機制。本研究結(jié)果表明：(1) 1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d,采用同位素放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)檢測斑馬魚性腺中性激素含量,結(jié)果表明：96h的暴露實驗發(fā)現(xiàn),卵巢E2水平在10μg/L濃度組出現(xiàn)極顯著降低；28d的暴露結(jié)果顯示,雌魚卵巢E2水平在1μg/L氨基脲濃度組顯著降低。另外,本實驗室另一位博士生的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d能夠抑制血漿中E2水平。因此我們認為氨基脲主要是通過抑制雌性斑馬魚卵巢內(nèi)E2的合成,拮抗E2水平,發(fā)揮抗雌激素效應(yīng)。(2) 1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/LL氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d,采用實時定量PCR檢測類固醇合成關(guān)鍵酶P450scc、P450c17、3β-HSD、 P450aromA的基因表達量變化,結(jié)果表明：96h的暴露結(jié)果表明,1μg/L、10μg/L、 100μg/L、100μg/L氨基脲暴露對卵巢3β-HSD1、P450c17、P450scc的表達均未產(chǎn)生顯著影響,450aromAmRNA表達水平在1、10、100μg/L濃度組顯著降低；28d的暴露結(jié)果顯示,卵巢P450aromA、P450c17、P450sccmRNA表達水平與對照組相比在不同濃度組均表現(xiàn)出不同程度降低,而3β-HSD1基因表達量無顯著變化。因此,我們認為氨基脲能夠下調(diào)雌魚卵巢細胞色素氧化酶的表達(主要是作用于限速酶P450aromA),抑制卵巢E2的合成。此外,E2與1μg/L、10μg/L、 100μg/L、1000μg/L氨基脲聯(lián)合暴露成年雄性斑馬魚96h/28d的結(jié)果表明：96h的聯(lián)合暴露實驗結(jié)果表明,氨基脲與E2聯(lián)合暴露相比E2單獨處理組主要在不同濃度降低類固醇合成酶基因P450aromA、P450sccmRNA表達水平。氨基脲與E2聯(lián)合暴露雄性斑馬魚28d的結(jié)果顯示,與E2單獨處理組相比,E2與氨基脲的聯(lián)合暴露能夠在不同濃度下降低P450aromA、P450c17、P450sccmRNA表達水平。聯(lián)合暴露的實驗結(jié)果表明,氨基脲主要是通過拮抗外源添加E2在成年雄性斑馬魚體內(nèi)引起的芳香化酶表達量的上調(diào),進而發(fā)揮抗雌激素效應(yīng)。(3)1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L氨基脲暴露成年雌性斑馬魚96h/28d,采用實時定量PCR檢測HPG軸上調(diào)控E2合成的相關(guān)因子FSHβ、LHβ、sGnRH、 P450aromB基因表達量,結(jié)果表明：96h/28d的結(jié)果顯示,1μg/L、10μg/L氨基脲暴露顯著降低雌性斑馬魚腦中sGnRH、FSHβ基因表達量。因此,我們認為氨基脲通過下調(diào)下丘腦sGnRH的表達降低垂體中FSHβmRNA的表達水平,進而抑制芳香化酶的活性。此外,E2與1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L的氨基脲聯(lián)合暴露成年雄性斑馬魚96h/28d的結(jié)果顯示：96h的暴露實驗發(fā)現(xiàn),E2與1μg/L、10μg/L氨基脲聯(lián)合暴露相比E2單獨處理組顯著降低sGnRHmRNA的表達水平；28d的結(jié)果顯示,與E2單獨處理組相比,E2與1μg/L氨基脲聯(lián)合暴露導(dǎo)致雄性斑馬魚腦中FSHfi、LHβ、sGnRHmRNA的表達水平較E2單獨處理組均顯著降低,因此我們認為氨基脲主要是通過拮抗外源添加E2在成年雄性斑馬魚腦中引起的sGnRH、FSHfi表達量的上調(diào),發(fā)揮其抗雌激素效應(yīng)。綜上,通過我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),氨基脲發(fā)揮抗雌激素效應(yīng)的機制是通過抑制斑馬魚下丘腦中HPG軸起始因子sGnRH的表達,進一步下調(diào)垂體FSHmRNA的表達水平,進而抑制卵巢中細胞色素氧化酶P450家族(主要是P450aromA)基因表達量,最終抑制卵巢E2的合成,拮抗E2水平,發(fā)揮抗雌激素效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：氨基脲 抗雌激素效應(yīng)機制 17β-雌二醇 類固醇合成酶 下丘腦-垂體-性腺軸
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：X503.22;S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 前言12-14
• 1 環(huán)境污染物的抗雌激素效應(yīng)及機制研究進展14-26
• 1.1 具有抗雌激素效應(yīng)的環(huán)境污染物14-16
• 1.2 環(huán)境污染物的抗雌激素效應(yīng)16-17
• 1.2.1 拮抗E_2水平16
• 1.2.2 拮抗E_2的功能16-17
• 1.2.3 拮抗雌性性征17
• 1.3 環(huán)境污染物的抗雌激素效應(yīng)機制17-23
• 1.3.1 干擾E_2合成17-19
• 1.3.2 干擾E_2的運輸19
• 1.3.3 干擾E_2與相應(yīng)受體結(jié)合19-22
• 1.3.4 干擾E_2代謝22-23
• 1.4 研究展望23-24
• 1.4.1 以孕激素為指標研究抗雌激素效應(yīng)23
• 1.4.2 從神經(jīng)內(nèi)分泌角度研究抗雌激素效應(yīng)23-24
• 1.4.3 從HPA、HPT、HPG軸的交互作用角度研究抗雌激素效應(yīng)24
• 1.5 研究目的與技術(shù)路線24-26
• 2 氨基脲對斑馬魚的抗雌激素效應(yīng)26-37
• 2.1 材料與方法26-30
• 2.1.1 實驗材料26-27
• 2.1.2 實驗藥品與儀器27
• 2.1.3 實驗方法27-30
• 2.1.4 數(shù)據(jù)處理30
• 2.2 結(jié)果30-34
• 2.2.1 96h暴露實驗結(jié)果30-32
• 2.2.2 28d暴露實驗結(jié)果32-34
• 2.3 討論34-36
• 2.4 小結(jié)36-37
• 3 從性激素相關(guān)合成酶的角度探討氨基脲的抗雌激素效應(yīng)機制37-50
• 3.1 材料與方法38-41
• 3.1.1 實驗材料38
• 3.1.2 實驗藥品與儀器38-39
• 3.1.3 實驗方法39-40
• 3.1.4 數(shù)據(jù)處理40-41
• 3.2 結(jié)果41-47
• 3.2.1 96h暴露實驗結(jié)果41-44
• 3.2.2 28d暴露實驗結(jié)果44-47
• 3.3 討論47-49
• 3.4 小結(jié)49-50
• 4 從HPG軸對E_2調(diào)控的角度探討氨基脲的抗雌激素效應(yīng)機制50-63
• 4.1 材料與方法51-52
• 4.1.1 實驗材料51
• 4.1.2 實驗藥品與儀器51
• 4.1.3 實驗方法51-52
• 4.1.4 數(shù)據(jù)處理52
• 4.2 結(jié)果52-58
• 4.2.1 96h暴露實驗結(jié)果52-55
• 4.2.2 28d暴露實驗結(jié)果55-58
• 4.3 討論58-61
• 4.4 小結(jié)61-63
• 5 結(jié)論與創(chuàng)新63-64
• 5.1 結(jié)論63
• 5.2 創(chuàng)新點63-64
• 參考文獻64-73
• 縮略詞對照表73-75
• 致謝75-76
• 個人簡歷76
• 發(fā)表的學術(shù)論文76

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本文編號：296911