miR166a及靶基因LMBR1在百合體胚發(fā)育及形態(tài)建成中的功能研究
發(fā)布時間：2021-01-11 23:06
百合觀賞性強、商業(yè)價值高,是在國際領域占有重要地位的球根花卉,但其種球繁殖和種質創(chuàng)新還存在許多問題需要解決。體細胞胚發(fā)生具有繁殖系數高、變異率低等諸多優(yōu)點,是有望解決上述問題的有效途徑,但百合體胚發(fā)生的分子機制尚不明確。本課題組前期研究表明miR166a在百合體胚發(fā)生過程中差異表達,但其靶基因LpLMBR1的功能在植物中尚未見報道。為探索lpu-miR166a及其靶基因LpLMBR1在百合體胚發(fā)生及形態(tài)建成中的功能,本研究克隆了細葉百合（Lilium pumilum DC.Fisch）miR166a初級體（lpu-pri-miR166a）及其靶基因LpLMBR1完整CDS區(qū)域,并進行了生物信息學分析。借助于課題組建立的百合穩(wěn)定高效遺傳轉化體系,通過基因過表達、敲除及沉默等技術,初步明確了 miR166a在百合體細胞胚發(fā)生及形態(tài)建成中的作用,首次在植物中探討了LpLMBRl的功能。主要研究結果如下:1.克隆得到LpLMBRl完整CDS序列;LpLMBRl編碼蛋白為疏水性蛋白,位于胞外,是膜的固有組成成分,起著細胞連接的作用;LpLMBR1在細葉百合的葉片、根和鱗片中特異性表達,其中葉片中...
【文章來源】：沈陽農業(yè)大學遼寧省
【文章頁數】：60 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
左pRI101-ON載體，右pRI101-ON載體多克隆位點Fig.2-1LeftimagepRI101-ONvector,RightimagepRI101-ONvectormulti-clonebit
2lpu-miR166a初級體、LpLMBR1的克隆及生物信息學分析13挑選生長健壯的4-5周的本氏煙草，用1mL注射器吸取重懸菌液，由煙草葉片下表皮輕輕注射，直至菌液充滿整個葉片，暗培養(yǎng)2d后光培養(yǎng)1d，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片的熒光情況。2.2結果與分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由圖2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR擴增片段大小在500bp左右，與預期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，測序結果表明PCR產物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息學分析測序結果表明lpu-pri-miR166a為501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中查找其他物種的pre-miR166a序列。經過比對發(fā)現，lpu-pri-miR166a片段中miR166前體與蘆筍的miR166的前體相似度可達98%、茶樹95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase數據庫（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前體序列，包括：蘆筍、水稻、茶樹、毛果楊、柑橘以及模式作物擬南芥、煙草和觀賞性作物海棠、向日葵。將查詢得到的miR166a前體與細葉百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp圖2-2（左）lpu-pri-miR166a擴增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12圖2-3miR166a前體序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
2lpu-miR166a初級體、LpLMBR1的克隆及生物信息學分析13挑選生長健壯的4-5周的本氏煙草，用1mL注射器吸取重懸菌液，由煙草葉片下表皮輕輕注射，直至菌液充滿整個葉片，暗培養(yǎng)2d后光培養(yǎng)1d，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片的熒光情況。2.2結果與分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由圖2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR擴增片段大小在500bp左右，與預期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，測序結果表明PCR產物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息學分析測序結果表明lpu-pri-miR166a為501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中查找其他物種的pre-miR166a序列。經過比對發(fā)現，lpu-pri-miR166a片段中miR166前體與蘆筍的miR166的前體相似度可達98%、茶樹95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase數據庫（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前體序列，包括：蘆筍、水稻、茶樹、毛果楊、柑橘以及模式作物擬南芥、煙草和觀賞性作物海棠、向日葵。將查詢得到的miR166a前體與細葉百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp圖2-2（左）lpu-pri-miR166a擴增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12圖2-3miR166a前體序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
【參考文獻】：
期刊論文
[1]龍眼體胚發(fā)生早期miR166初級體的克隆與表達分析[J]. 張清林,蘇立遙,厲雪,張舒婷,徐小萍,陳曉慧,王培育,李蓉,張梓浩,陳裕坤,賴鐘雄,林玉玲. 園藝學報. 2018(08)
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[4]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
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[10]百合花特異啟動子PchsA表達載體的構建及功能分析[J]. 常小麗,劉雅莉,王躍進,徐偉榮,張宗勤. 西北農林科技大學學報(自然科學版). 2009(02)
博士論文
[1]百合VIGS體系的建立及LhDTX35基因的克隆和功能研究[D]. 徐華.中國農業(yè)科學院 2018
[2]小麥不同生長發(fā)育時期miRNA的鑒定及2個穗/籽粒高表達miRNA功能的初步研究[D]. 簡超.西北農林科技大學 2017
[3]過表達LaMIR166a在落葉松ESMs成胚發(fā)育及其萌發(fā)過程中的功能研究[D]. 李哲馨.中國林業(yè)科學研究院 2017
[4]落葉松IAA受體基因分離與干細胞極性相關miR166及其目標基因功能研究[D]. 李水根.中國林業(yè)科學研究院 2013
碩士論文
[1]細葉百合2型金屬硫蛋白（LpMT2）基因的克隆及其功能解析[D]. 趙婧競.東北林業(yè)大學 2019
[2]利用STTM技術分析擬南芥miR160和miR165/166的互作網絡及玉米miR166的初步功能[D]. 楊天嘯.河南農業(yè)大學 2019
[3]百合單萜合成酶基因多態(tài)性研究和功能驗證[D]. 樊俊苗.山西農業(yè)大學 2018
[4]百合體胚發(fā)生過程中miR166及其靶基因的鑒定與表達分析[D]. 楊越.沈陽農業(yè)大學 2017
[5]垂花百合花青素基因 ANS 啟動子的克隆及功能分析[D]. 陰婷.沈陽農業(yè)大學 2016
[6]miR165/166對番茄形態(tài)建成的調控及對擬南芥逆境脅迫的響應[D]. 丁娜.山西農業(yè)大學 2016
[7]農桿菌介導GsZFP1基因轉化亞洲百合‘Cedeazzle’的研究[D]. 張煥.東北農業(yè)大學 2014
[8]RNAi介導的抗黃瓜花葉病毒和抗百合斑駁病毒載體的構建及百合的轉化研究[D]. 馮慧穎.中國農業(yè)科學院 2013
[9]番茄Sly-miR166及其靶標基因SlREV的克隆、鑒定及其對果實形成的研究[D]. 胡國建.重慶大學 2013
[10]花特異啟動子調控的藍色基因表達載體構建及功能研究[D]. 李莉.西北農林科技大學 2011
本文編號：2971650
【文章來源】：沈陽農業(yè)大學遼寧省
【文章頁數】：60 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
左pRI101-ON載體，右pRI101-ON載體多克隆位點Fig.2-1LeftimagepRI101-ONvector,RightimagepRI101-ONvectormulti-clonebit
2lpu-miR166a初級體、LpLMBR1的克隆及生物信息學分析13挑選生長健壯的4-5周的本氏煙草，用1mL注射器吸取重懸菌液，由煙草葉片下表皮輕輕注射，直至菌液充滿整個葉片，暗培養(yǎng)2d后光培養(yǎng)1d，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片的熒光情況。2.2結果與分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由圖2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR擴增片段大小在500bp左右，與預期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，測序結果表明PCR產物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息學分析測序結果表明lpu-pri-miR166a為501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中查找其他物種的pre-miR166a序列。經過比對發(fā)現，lpu-pri-miR166a片段中miR166前體與蘆筍的miR166的前體相似度可達98%、茶樹95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase數據庫（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前體序列，包括：蘆筍、水稻、茶樹、毛果楊、柑橘以及模式作物擬南芥、煙草和觀賞性作物海棠、向日葵。將查詢得到的miR166a前體與細葉百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp圖2-2（左）lpu-pri-miR166a擴增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12圖2-3miR166a前體序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
2lpu-miR166a初級體、LpLMBR1的克隆及生物信息學分析13挑選生長健壯的4-5周的本氏煙草，用1mL注射器吸取重懸菌液，由煙草葉片下表皮輕輕注射，直至菌液充滿整個葉片，暗培養(yǎng)2d后光培養(yǎng)1d，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察葉片的熒光情況。2.2結果與分析2.2.1lpu-pri-miR166a及其靶基因LpLMBR1的克隆由圖2-2可知，lpu-pri-miR166aPCR擴增片段大小在500bp左右，與預期片段大小相符；LpLMBR1克隆得到1800bp大小的片段，測序結果表明PCR產物1881bp。2.2.2lpu-pri-miR166a生物信息學分析測序結果表明lpu-pri-miR166a為501bp。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中查找其他物種的pre-miR166a序列。經過比對發(fā)現，lpu-pri-miR166a片段中miR166前體與蘆筍的miR166的前體相似度可達98%、茶樹95%、小果野芭蕉95%、水稻93%等。在miRBase數據庫（http://www.mirbase.org/cgi-bin/blast.pl）中查找其它作物miR166a前體序列，包括：蘆筍、水稻、茶樹、毛果楊、柑橘以及模式作物擬南芥、煙草和觀賞性作物海棠、向日葵。將查詢得到的miR166a前體與細葉百合中克隆得到的miR166a前2000bp1000bp500bp250bp100bpM12750bp圖2-2（左）lpu-pri-miR166a擴增片段，（右）LpLMBR1克隆Fig.2-2(left)lpu-pri-miR166aamplificationfragment,(right)LpLMBR1clone2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM12圖2-3miR166a前體序列分析Fig.2-3pre-miR166asequenceanalysis
【參考文獻】：
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[9]MIR166基因家族在陸生植物中的進化模式分析（英文）[J]. 趙旭耀,陳斯云,趙磊,張雪梅,馬朋飛,郭振華. 植物分類與資源學報. 2014(03)
[10]百合花特異啟動子PchsA表達載體的構建及功能分析[J]. 常小麗,劉雅莉,王躍進,徐偉榮,張宗勤. 西北農林科技大學學報(自然科學版). 2009(02)
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[2]小麥不同生長發(fā)育時期miRNA的鑒定及2個穗/籽粒高表達miRNA功能的初步研究[D]. 簡超.西北農林科技大學 2017
[3]過表達LaMIR166a在落葉松ESMs成胚發(fā)育及其萌發(fā)過程中的功能研究[D]. 李哲馨.中國林業(yè)科學研究院 2017
[4]落葉松IAA受體基因分離與干細胞極性相關miR166及其目標基因功能研究[D]. 李水根.中國林業(yè)科學研究院 2013
碩士論文
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[2]利用STTM技術分析擬南芥miR160和miR165/166的互作網絡及玉米miR166的初步功能[D]. 楊天嘯.河南農業(yè)大學 2019
[3]百合單萜合成酶基因多態(tài)性研究和功能驗證[D]. 樊俊苗.山西農業(yè)大學 2018
[4]百合體胚發(fā)生過程中miR166及其靶基因的鑒定與表達分析[D]. 楊越.沈陽農業(yè)大學 2017
[5]垂花百合花青素基因 ANS 啟動子的克隆及功能分析[D]. 陰婷.沈陽農業(yè)大學 2016
[6]miR165/166對番茄形態(tài)建成的調控及對擬南芥逆境脅迫的響應[D]. 丁娜.山西農業(yè)大學 2016
[7]農桿菌介導GsZFP1基因轉化亞洲百合‘Cedeazzle’的研究[D]. 張煥.東北農業(yè)大學 2014
[8]RNAi介導的抗黃瓜花葉病毒和抗百合斑駁病毒載體的構建及百合的轉化研究[D]. 馮慧穎.中國農業(yè)科學院 2013
[9]番茄Sly-miR166及其靶標基因SlREV的克隆、鑒定及其對果實形成的研究[D]. 胡國建.重慶大學 2013
[10]花特異啟動子調控的藍色基因表達載體構建及功能研究[D]. 李莉.西北農林科技大學 2011
本文編號：2971650
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