本文關(guān)鍵詞：煙草抗馬鈴薯Y病毒miRNA的篩選及相關(guān)miRNA的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,馬鈴薯Y病毒(PVY)是煙草上的主要病害之一,近幾年,PVY在我國(guó)煙草主要產(chǎn)區(qū)爆發(fā)成災(zāi),并且存在逐年加重的趨勢(shì)。目前生產(chǎn)上對(duì)于PVY的防治尚無(wú)有效的藥劑,因此,培育抗PVY的煙草品種是防治該病害最為有效的辦法。然而,了解病毒與煙草相互作用的分子機(jī)理是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。研究表明,microRNA(miRNA)在調(diào)節(jié)植物對(duì)病毒的抗性方面具有重要作用,本文在探究PVY侵染對(duì)植物內(nèi)源miRNA表達(dá)的變化的基礎(chǔ)上,探索是否可以通過(guò)調(diào)控內(nèi)源niRNA基因的表達(dá)從而起到抗病毒作用,為煙草的病毒防治和抗病育種提供一個(gè)新的思路。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下：1.對(duì)PVY侵染煙草樣品及健康對(duì)照進(jìn)行了小RNA(smallRNA,sRNA)測(cè)序,通過(guò)分析PVY侵染后煙草內(nèi)源miRNA表達(dá)譜的變化,表明PVY能夠顯著影響煙草內(nèi)源81個(gè)miRNA表達(dá)發(fā)生變化,其中上調(diào)表達(dá)niRNA57個(gè),下調(diào)表達(dá)21個(gè),對(duì)表達(dá)差異的niRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。2.選擇表達(dá)顯著上調(diào)的煙草nta-mR156g、nta-miR396b、nta-miR169a、nta-miR6149a,顯著下調(diào)的nta-miR6019a以及表達(dá)差異不顯著的nta-miR168a、nta-miR172c進(jìn)行Northern印跡雜交驗(yàn)證,雜交結(jié)果與測(cè)序及差異分析結(jié)果基本一致。3.篩選出nta-miR396b作為本文的研究對(duì)象,構(gòu)建了nta-miR396b基因超量表達(dá)的植物表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,將nta-miR396b轉(zhuǎn)入煙草栽培品種“K326”中,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。將轉(zhuǎn)基因植株自交至T2代,用于后期研究。4.對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因煙草以未轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照進(jìn)行PVY的抗病性鑒定,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)病延緩,癥狀較未轉(zhuǎn)基因煙草明顯減弱,證實(shí)煙草miR396b具有抗PVY侵染的功能。本研究從miRNA的角度尋找PVY的防治途徑,證明了煙草內(nèi)源miRNA具有抗PVY侵染的功能。表明植物能以調(diào)節(jié)內(nèi)源miRNA表達(dá)的方式間接抵抗病毒的侵染這一相互關(guān)系的存在,為植物抗病毒研究提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：馬鈴薯Y病毒 microRNA(miRNA) 超量表達(dá)載體構(gòu)建 轉(zhuǎn)基因植株
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S435.72
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-23
• 1.1 煙草病害介紹9
• 1.2 馬鈴薯Y病毒對(duì)煙草的危害9-10
• 1.3 馬鈴薯Y病毒的致病機(jī)理10-11
• 1.4 植物miRNA的研究進(jìn)展11-20
• 1.4.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)及特征11
• 1.4.2 植物miRNA的合成與作用方式11-13
• 1.4.3 MiRNA調(diào)控植物發(fā)育13-14
• 1.4.4 MiRNA途徑介導(dǎo)的基因表達(dá)14-15
• 1.4.5 MiRNA在逆境中的響應(yīng)機(jī)制15-16
• 1.4.6 MiRNA的研究方法16-20
• 1.5 MiRNA對(duì)植物病毒的響應(yīng)20-21
• 1.6 研究的來(lái)源及目的意義21-23
• 1.6.1 研究課題的來(lái)源21
• 1.6.2 研究的目的意義21-23
• 2 篩選煙草抗PVY的miRNA23-33
• 2.1 材料與方法23-26
• 2.1.1 煙草總RNA的提取23-24
• 2.1.2 煙草sRNA序列分析24
• 2.1.3 煙草miRNA注釋分析24
• 2.1.4 煙草miRNA深層分析24-25
• 2.1.5 差異表達(dá)的miRNA雜交驗(yàn)證25-26
• 2.2 結(jié)果與分析26-33
• 2.2.1 RNA質(zhì)量電泳結(jié)果26-27
• 2.2.2 SRNA測(cè)序結(jié)果27
• 2.2.3 SRNA長(zhǎng)度分析27-29
• 2.2.4 煙草sRNA注釋分析29
• 2.2.5 煙草miRNA深層分析29-32
• 2.2.6 差異表達(dá)的miRNA雜交驗(yàn)證32-33
• 3 Nta-miR396b的抗馬鈴薯Y病毒功能分析33-46
• 3.1 材料與方法33-40
• 3.1.1 合成nta-miR396b的前體序列33
• 3.1.2 超量表達(dá)載體的構(gòu)建33-34
• 3.1.3 Nta-miR396b表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌34-35
• 3.1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化35-37
• 3.1.5 煙草葉片基因組DNA提取37
• 3.1.6 基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)37
• 3.1.7 轉(zhuǎn)基因煙草Southern雜交驗(yàn)證37-39
• 3.1.8 轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性鑒定39
• 3.1.9 病毒含量測(cè)定39-40
• 3.2 結(jié)果與分析40-46
• 3.2.0 合成nta-miR396b前體序列40
• 3.2.1 Nta-miR396b超量表達(dá)載體的構(gòu)建40-41
• 3.2.2 Nta-miR396b超量表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化大腸桿菌41
• 3.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化41-43
• 3.2.4 PCR檢測(cè)43-44
• 3.2.5 Southern雜交驗(yàn)證44
• 3.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草抗病性鑒定44-45
• 3.2.7 病毒含量測(cè)定45-46
• 4 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-56
• 附錄56-112
• 個(gè)人簡(jiǎn)介112-113
• 致謝113

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本文編號(hào)：295987