南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)的一個(gè)暫定種,由介體昆蟲白背飛虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式傳播,但不經(jīng)卵傳播。由SRBSDV引發(fā)的南方水稻黑條矮縮病在我國南方稻區(qū)以及越南稻區(qū)等地暴發(fā)流行給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于病毒在介體昆蟲體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)、復(fù)制和裝配等起著重要作用。SRBSDV編碼的P5-1、P6和P9-1蛋白是病毒原質(zhì)的組分,參與病毒的復(fù)制和裝配。但是同為病毒原質(zhì)的組分,P5-1、P6和P9-1各自在病毒原質(zhì)和病毒復(fù)制中起著什么作用還沒有明確。RNAi技術(shù)是近年來研究基因功能的一個(gè)重要技術(shù)手段,利用RNAi技術(shù)進(jìn)行植物病毒病的防治已成為重要的手段。因此,本研究擬利用RNAi技術(shù)鑒定SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)復(fù)制起始的關(guān)鍵基因,為病毒病的防控提供一個(gè)高效靶標(biāo)基因。本實(shí)驗(yàn)首先擴(kuò)增SRBSDV-P5-1N-端1-750 bp基因片段,通過Gateway體系構(gòu)建原核表達(dá)載體,特異性誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白條帶后注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體,Western blot和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)的檢測結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)所制備的多克隆抗體能特異性檢測SRBSDV侵染水稻和白背飛虱表達(dá)的P5-1蛋白,表明本實(shí)驗(yàn)所制備P5-1多克隆抗體具有較好的特異性。以SRBSDV病毒原質(zhì)組分P5-1、P6和P9-1蛋白為研究對(duì)象,利用T7轉(zhuǎn)錄酶體外合成其雙鏈RNA (double-stand RNA, dsRNA),利用顯微注射法將濃度約為0.5 μg/μL的dsRNA導(dǎo)入飼毒2d的白背飛虱體內(nèi),同時(shí)以注射dsGFP的處理為對(duì)照。注射后6d用相關(guān)蛋白的熒光抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),分別干擾P5-1、P6和P9-1基因表達(dá)后,均能明顯抑制相關(guān)基因P5-1、P6、P9-1、P7-1和P10在白背飛虱體內(nèi)的表達(dá),且病毒被限制在初侵染的中腸上皮細(xì)胞中,沒有發(fā)生擴(kuò)散。抑制P5-1蛋白表達(dá)后,P6和P9-1蛋白仍可表達(dá),但僅限于在初侵染細(xì)胞中表達(dá),P7-1和P10蛋白表達(dá)受到明顯抑制,認(rèn)為P5-1作為與病毒粒體裝配有關(guān)的蛋白,其調(diào)控著外殼蛋白和擴(kuò)散相關(guān)蛋白的表達(dá),從而阻礙了病毒在白背飛虱體內(nèi)的裝配和擴(kuò)散。干擾P6蛋白的表達(dá)后,84%的昆蟲體內(nèi)檢測不到P6蛋白,同時(shí)也檢測不到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白,但在16%的昆蟲上皮細(xì)胞內(nèi)可檢測到P6蛋白,此時(shí)也可檢測到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白,表明P6蛋白不表達(dá)則不能啟動(dòng)病毒的增殖,一旦P6蛋白有少量的表達(dá)則啟動(dòng)病毒在上皮細(xì)胞內(nèi)的增殖。抑制P9-1蛋白的表達(dá)后,P6蛋白仍可表達(dá),但也僅局限在初侵染的上皮細(xì)胞內(nèi),而P5-1蛋白的表達(dá)受到抑制,同時(shí)P7-1和P10蛋白的表達(dá)也受到明顯抑制,表明參與病毒基因組復(fù)制的P9-1蛋白表達(dá)受抑制后,參與病毒裝配的P5-1蛋白和外殼蛋白P10的表達(dá)受到抑制,同時(shí)由于病毒無法裝配,使管狀結(jié)構(gòu)蛋白P7-1表達(dá)受到抑制。此外,本實(shí)驗(yàn)通過RT-qPCR檢測了dsRNA對(duì)病毒增殖的影響,發(fā)現(xiàn)干擾P5-1、P6和P9-1基因的表達(dá)后,編碼病毒外殼蛋白的P10基因拷貝數(shù)相對(duì)處理組明顯下降,表明病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制和增殖受到阻礙。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)分別抑制P5-1、P6和P9-1蛋白的表達(dá)后,能明顯抑制其它相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中抑制P5-1蛋白表達(dá)后,能檢測P6和P9-1蛋白能有少量表達(dá),P10幾乎沒有表達(dá),干擾P6表達(dá)后,均沒有檢測到相關(guān)蛋白的表達(dá)；抑制P9-1蛋白表達(dá)后,P6蛋白有少量表達(dá),其余相關(guān)蛋白均沒有檢測到。綜上所述,本研究通過dsRNA誘導(dǎo)的RNAi技術(shù),明確了P5-1、P6和P9-1均是SRBSDV在昆蟲體內(nèi)增殖的重要蛋白,抑制單個(gè)基因的表達(dá)均能明顯抑制病毒在介體昆蟲體內(nèi)的復(fù)制和擴(kuò)散。P6蛋白在病毒增殖中起最關(guān)鍵的作用,負(fù)責(zé)啟動(dòng)病毒在初侵染上皮細(xì)胞內(nèi)的增殖,抑制P6蛋白的表達(dá)則抑制病毒所有蛋白的表達(dá)；P9-1蛋白作為病毒基因組復(fù)制的場所,其表達(dá)受抑制后則間接調(diào)控與病毒裝配有關(guān)蛋白的不表達(dá)：P5-1蛋白作為病毒裝配的場所,抑制其表達(dá)則調(diào)控病毒外殼蛋白及管狀結(jié)構(gòu)蛋白P7-1的表達(dá)。因此,我們認(rèn)為P6蛋白是病毒增殖過程中最關(guān)鍵的因子,對(duì)病毒原質(zhì)的形成發(fā)揮啟動(dòng)作用,可作為病毒病防控的理想靶標(biāo)蛋白。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S433
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 南方水稻黑條矮縮病毒的研究進(jìn)展
        1.1.1 南方水稻黑條矮縮病的發(fā)現(xiàn)、分布以及危害
        1.1.2 南方水稻黑條矮縮病的表型癥狀特點(diǎn)
        1.1.3 南方水稻黑條矮縮病的自然寄主和傳播介體
        1.1.4 SRBSDV的病毒學(xué)分類地位
        1.1.5 SRBSDV的基因組結(jié)構(gòu)及其功能研究
    1.2 植物呼腸孤病毒復(fù)制場所—病毒原質(zhì)的研究進(jìn)展
    1.3 植物病毒在介體昆蟲體內(nèi)的侵染循回過程
    1.4 原核表達(dá)系統(tǒng)的研究概況以及應(yīng)用
    1.5 RNAi的發(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用
        1.5.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        1.5.2 RNAi的原理
        1.5.3 RNAi技術(shù)應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
2 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和載體
        2.1.2 水稻病株和介體昆蟲白背飛虱
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)主要器材
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 SRBSDV蛋白P5-1抗體的制備
            2.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)和合成
            2.2.1.2 感染SRBSDV的水稻總RNA提取
            2.2.1.3 RT-PCR擴(kuò)增SRBSDV的基因片段P5-1
            2.2.1.4 純化回收擴(kuò)增的SRBSDVP5-1產(chǎn)物
            2.2.1.5 入門載體pDONR221-P5-1的構(gòu)建
            2.2.1.6 原核表達(dá)載體pDEST17-P5-1的構(gòu)建
            2.2.1.7 原核表達(dá)載體pDEST17-P5-1轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）菌株
            2.2.1.8 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1的原核誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.1.9 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1抗血清的制備
            2.2.1.10 P5-1抗血清的特異性檢測
            2.2.1.11 P5-1抗血清的純化
            2.2.1.12 抗體交聯(lián)熒光素
            2.2.1.13 P5-1在SRBSDV侵染的白背飛虱體內(nèi)的分布
        2.2.2 源于SRBSDV基因片段的dsRNAs對(duì)病毒侵染白背飛虱的影響
            2.2.2.1 dsRNA的引物設(shè)計(jì)和合成
            2.2.2.2 微針注射體外合成的dsRNA
            2.2.2.3 免疫熒光標(biāo)記檢測dsRNAs處理對(duì)SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)侵染的影響
            2.2.2.4 RT-qPCR檢測體dsRNAs處理對(duì)SRBSDV侵染白背飛虱的影響
            2.2.2.5 Western blot檢測dsRNAs處理后SRBSDV編碼的相關(guān)蛋白在白背飛虱體內(nèi)表達(dá)量的變化
3 結(jié)果分析
    3.1 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1抗體的制備
        3.1.1 RT-PCR擴(kuò)增目的片段
        3.1.2 入門載體pDONR221-P5-1的構(gòu)建
        3.1.3 原核表達(dá)載體pDEST17-P5-1的構(gòu)建
        3.1.4 原核表達(dá)載體pDEST17-P5-1轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）菌株
        3.1.5 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1的原核誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.6 Western blot檢測抗血清的特異性
        3.1.7 P5-1在SRBSDV侵染的白背飛虱體內(nèi)的分布
    3.2 dsRNAs處理對(duì)SRBSDV侵染白背飛虱的影響
        3.2.1 dsRNA的合成
        3.2.2 dsP5-1處理對(duì)病毒相關(guān)基因在白背飛虱體內(nèi)的表達(dá)的影響
        3.2.3 dsP6處理對(duì)病毒相關(guān)基因在白背飛虱體內(nèi)的表達(dá)的影響
        3.2.4 dsP9-1處理對(duì)病毒相關(guān)基因在白背飛虱體內(nèi)的表達(dá)的影響
    3.3 干擾單個(gè)基因表達(dá)明顯抑制病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制
    3.4 dsRNA處理抑制SRBSDV相關(guān)基因在蛋白水平上的表達(dá)
4 討論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

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