精子載體介導的轉基因技術操作簡單,成本低廉,自Lvaitran 1989年提出以來受到了人們的廣泛關注。但是由于精子載體法精子存在在體外與外源DNA共孵育使精子活力下降影響與卵細胞結合使受精困難、外源DNA無法整合到動物細胞基因組等缺陷,很大程度上限制了精子載體技術的發(fā)展與應用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前已經在眾多研究人員實驗結果中表現出強大的定點基因編輯能力,這一特點和精子載體法相結合制備基因編輯(基因突變)的遺傳修飾的轉基因動物具有一定的可行性。探討將兩個技術結合制備基因編輯雞在目前轉基因雞制備技術尚不成熟的情況下,具有重要的意義。因此,本試驗旨在通過以雞生長激素受體基因(Growth hormone receptor,GHR)為模型,篩選出高效的sgRNA,建立精子載體脂質體孵育條件,將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與精子載體技術結合,期望建立簡單高效廉價的制備遺傳修飾雞的方法。主要研究內容及結果如下:高活性sgRNA體外酶切篩選:實驗首先根據矮小型雞生長激素受體基因缺失部分的外顯子區(qū)用在線sgRNA設計軟件設計5對sgRNA序列,并且分別構建出前邊插入了 T7啟動子的sgRNA的體外轉錄載體pT7-sgRNA-trac,轉錄出對應的sgRNA。按照Cas9體外酶切試劑盒說明書將Cas9蛋白、sgRNA和體外切割底物按比例混合孵育,酶切結果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果:sgRNA1體外切割效率為82.1%,sgRNA2體外切割效率為57.4%,sgRNA3體外切割效率為92.5%,sgRNA4體外切割效率為33.7%,sgRNA5體外切割效率為95.4%。sgRNA活性的DF-1細胞內鑒定及sgRNA脫靶分析:選擇靶向GHR基因體外酶切效率較高的sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5,構建出相應的sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表達載體。構建左右同源臂質粒載體pMD19T-zyb,將Neo R表達結構和左右同源臂連接構建打靶載體pMD19T-Neo-zyb。將sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表達載體分別和打靶載體共轉染DF-1細胞,用G418篩選,挑單克隆細胞并且增殖培養(yǎng),將所有陽性單克隆細胞基因組DNA通過PCR擴增鑒定NeoR定點插入,并且將鑒定未定點插入的單克隆細胞基因組通過PCR擴增GHR基因檢測靶點處基因序列并進行測序鑒定靶位點處是否發(fā)生編輯,其中sgRNA1獲得16株細胞克隆有2株為定點插入陽性,編輯效率為12.5%;sgRNA3獲得23株細胞克隆有9株為定點插入陽性,2株為未定點插入但靶點序列發(fā)生突變,編輯效率為47.8%;sgRNA5獲得24株細胞克隆有11株為定點插入陽性,2株為未定點插入但靶點序列發(fā)生突變,編輯效率為54.2%。根據在線脫靶分析軟件設計對sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5分別選出5個潛在脫靶位點,并設計相應引物,以篩選到的所有Neo R抗性為陽性的細胞克隆基因組為模板PCR擴增出對應潛在脫靶位點序列并測序:分別選出的5個潛在脫靶位點均未檢測到sgRNA發(fā)生脫靶。精子孵育條件建立:采集新鮮公雞精液,取200μL精液,洗滌液同孵育液洗滌精清,孵育液分別為稀釋液、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液,孵育時間分別為10min、30min、60min、90min,觀察精子活力選擇合適的孵育液,選擇能維持精子較高活力的孵育液分別與pX330質粒共孵育10min、30min、60min、90min,觀察精子活力并且以半定量PCR鑒定攝取外源DNA情況篩選出最優(yōu)孵育時間;另一組試驗為孵育前分別用0μL、1μL、1.5 μL、2 μL脂質體包被質粒DNA,孵浴時間60 min,半定量PCR鑒定攝取外源DNA情況及有活力的精子所占比例綜合選擇合適的脂質體體積;通過人工授精,比較不同孵育方法受精率,并PCR鑒定攜帶外源DNA的受精蛋胚盤數以確定最佳孵育方法。結果不同孵育液孵育后,M199培養(yǎng)液做為孵育液孵育后有活力的精子所占比例顯著高于其他組(P0.05),孵育時間60 min時為最佳孵育時間;脂質體孵育最佳的脂質體用量為1.5μL;普通孵育處理的受精率為51.18%,脂質體孵育處理的受精率為44.78%,差異不顯著(P0.05),簡單孵育外源DNA 陽性率為14.94%,脂質體孵育外源DNA 陽性率28.89%,差異顯著(P0.05)。編輯胚胎或個體的鑒定:將DF-1細胞篩選高效的sgRNA、Cas9蛋白、EGFP共表達載體與精子在建立的合適孵育條件下脂質體共孵育,人工授精,第X期胚盤水平和剛出殼雛雞組織水平檢測基因編輯:第X期胚盤1087枚,鑒定出3枚受精蛋發(fā)生基因編輯,初步估計編輯效率為0.28%,發(fā)生基因編輯的3枚受精蛋中發(fā)生基因編輯細胞數分別占第X期總細胞數的比例初步估計為10.4%、12.5%、10.4%,經雞胚基因組DNA進行PCR鑒定性別,發(fā)生基因編輯的3枚受精蛋均為雌性,推測CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)生基因編輯的時期在受精卵發(fā)育到8細胞期之前;雛雞組織未鑒定出發(fā)生基因編輯的樣品,導致的原因可能是多樣的。本試驗通過將篩選靶向GHR基因的高效sgRNA,建立適合雞精子載體的孵育條件,將兩者相結合,在第X期胚盤中實現了定點基因編輯,為矮小雞制備建立了一個新的技術方法,同時也為其他基因編輯及甚至基因打靶的轉基因雞的制備提供了新的思路和方法。
【學位單位】：河北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S831
【部分圖文】：

ＮＡ的識別切割目前使用最廣泛的就??由ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)改造而來ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)，通過人工設計ｓｇＲＮＡ，引導Ｃａｓ９蛋白對特??異序列識別并切割，造成ＤＮＡ雙鏈斷裂（ｄｏｕｂｌｅ?ｓｔｒａｎｄ?ｂｒｅａｋ，?ＤＳＢ）。ＤＳＢ就會促使細胞啟動??ＤＮＡ損傷修復機制：非同源末端連接（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄ?ｊｏｉｎｉｎｇ，?ＮＨＥＪ）［５９１和同源重組修復??（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ?ｒｅｐａｉｒ，?ＨＤＲ）＿，從而實現基因序列的插入、缺失、替換，見圖１－１。對于??ＳｇＲＮＡ，?ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ識別的Ｕ６或Ｈ１啟動子在啟動轉錄時依賴的聚合酶在ＲＮＡ的５＇端需??要Ｇ或ＧＧ，所以目前研宄者常在設計ｓｇＲＮＡ的５＇端無Ｇ或ＧＧ時，合成引物時在ｓｇＲＮＡ的??５＇端加Ｇ或ＧＧ，既可以合成有活性的ｓｇＲＮＡ，又可以提高Ｃａｓ９核酸酶編輯的效率［６｜１。２０１３??年，科學家在哺乳動物細胞中實現了對特定基因的編輯Ｍ，從此這項技術得到了迅速發(fā)展，推??動了生命科學多個領域的跨越式發(fā)展。??纖?ｆｃＷ＂乂Ｖ?，；??ｉｉ?ｌｉｔｉｉｉｉｉｉｎｎｉｉｉｒ??５?ｉｎｎＴｆｎＴｎＴＴＴｎＴｎ＾ｊ?丨１１??ＯＶＷＴＪＫ?ＤＭＡ?Ｘ?＇?＾??．細＜??ｌ??ｒ?ｉｌｌｌｌｉｌｉｌ??１??ｈｕｂｓ??ＢＢＢＳＥｌｌｉｌＳＩ?—，?ＢＥＳＳｐｉｐｉｌｌ??ｍＢＥ?１！?ｉｌｌｌｌｉ?＿工麵??ＭＥＩＨｌｌ：?ＳＨＩ??圖１－１?ＣＰＩＳＲＰ／Ｃａｓ９工作原理??ＦＩＧ．?１－１?Ｈｏｗ?ＣＰＩＳＲＰ／Ｃａｓ９?ｗｏｒｋｓ??１．３．２?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?的應用??隨著Ｃ

?河北農業(yè)大學碩士學位（畢業(yè)）論文???２材料方法??２．１儀器材料與實驗動物??２．１．１質粒與引物合成??ｐＸ３３０、ｐＥＧＦＰ－Ｎ２?質粒購買自美國?ａｄｄｇｅｎｅ?公司，ｐＭＤ１９－Ｔ?ｖｅｃｔｏｒ?和?ｐＭＤ１９?－Ｔ?ｓｉｍｐｌｅ?ｖｅｃｔｏｒ??載體購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，ｐＴ７－５ｔｅ／－ｔｒａｃ質粒（圖２－１－ａ?）、ｐＣＭＶ－ＮｅｏＲ－ｂｇｈ??質粒（圖２－１－ｂ?）由本實驗室改造，引物合成、基因測序均由深圳華大基因科技有限公司完成。??掛《ｓ?丨，Ｂｂｓｉ??〇?Ｉ?Ｊ??ａ?ｂ??圖２－１質粒結構示意圖??ＦＩＧ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??注：ａ：?ｐＴ７－＾Ｚｗ／－ｔｒａｃ質粒載體結構示意圖；ｂ：?ｐＣＭＶ－ＮｅｏＲ－ｂｇｈ質粒載體結構示意圖??Ｎｏｔｅ：?ａ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｅｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｔ７－ｂｂｓｉ－ｔｒａｃ；Ｂ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｅｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｃｍｖ－ｎｅｏｒ－ｂｇｈ??２．１．２實驗試劑及來源??ｄＮＴＰｓ?（２．５ｍ?Ｍｅａｃｈ）、Ｔａｑ?酶、６ＸＤＮＡ?ｌｏａｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ?ＤＨ５ａ感受態(tài)細胞、組織?ＤＭＡ??提取試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖，甘油，胰蛋白胨，瓊脂粉，酵母提取??粉，氯化鈉，無水乙醇，異丙醇均購自保定賽爾克公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北??京）有限公司；胎牛血清、ＤＭＥＭ培養(yǎng)液、Ｍ１９９培

５０°〇水�。保担保保必保�，轉化入￡．〇〇１丨０１１５〇１感受態(tài)細胞，搖菌５〇１１１１＾，提取質粒，方法參考質粒??提取試劑盒：將菌液在超凈臺中轉移到不同的５?ｍＬ無菌離心管中，１２０００?ｒｍｐ離心１?ｍｉｎ，盡量??吸凈上清培養(yǎng)液。加入２５０?ｐＬ溶液Ｉ?（預加ＲＮａｓｅＡ），用渦旋震蕩機充分渦旋震蕩使細菌細胞??重懸。向離心管中加入２５０吣溶液ＩＩ，輕輕上下顛倒幾次，使菌液充分裂解，此時混合液由渾??濁變的清澈。加入３５０吣溶液ＩＩＩ，立即上下顛倒充分混勻，出現白色沉淀，１２０００?ｒｍｐ離心１０?ｍｉｎ。??將上清液移入到吸附柱中，室溫放置２?ｍｉｎ，?１２０００?ｒｐｍ離心１?ｍｉｎ。倒掉收集管中的廢液，吸附??柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入７００?ｐＬ漂洗液（預加無水乙醇）１２０００?ｒｐｍ離心１?ｍｉｎ，??倒掉收集管中的廢液，１２０００?ｒｐｍ空離心３?ｍｉｎ，室溫開口在放置３?ｍｉｎ，使漂洗液去除。吸附柱??放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央加入４０ｐＬ預熱至６０°Ｃ的ｄｄＨ２０，室溫靜置５ｍｉｎ。??１２０００?ｒｐｍ離心１?ｍｉｎ，收集質粒溶液，做上標記，－２０°Ｃ保存。后續(xù)質粒提取實驗操作相同，質??粒命名為ＰＸ３３０－ＥＧＦＰ，其結構功能見圖２－２。??
【參考文獻】

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本文編號：2887146