隨著社會(huì)的發(fā)展,生活節(jié)奏的加快,人們承受的心理壓力越來(lái)越大,心理應(yīng)激會(huì)造成雌性生殖障礙,導(dǎo)致不孕,流產(chǎn)等各種疾病。束縛應(yīng)激是最經(jīng)典的心理應(yīng)激模型之一。研究表明束縛應(yīng)激會(huì)激活HPA(下丘腦-垂體-腎上腺)軸,并導(dǎo)致血清和卵巢中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotrophin-releasing Hormone,CRH)含量升高從而誘導(dǎo)壁顆粒細(xì)胞凋亡,但其機(jī)制尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明CRH水平升高通過(guò)Fas/FasL系統(tǒng)誘導(dǎo)壁顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞的凋亡;但FasL突變的gld小鼠實(shí)驗(yàn)中,也存在束縛應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這表明束縛應(yīng)激可能激活除Fas/FasL系統(tǒng)以外的其他通路。TNF-α系統(tǒng)同樣可以誘導(dǎo)多種組織和細(xì)胞的凋亡,但應(yīng)激過(guò)程中CRH是否也會(huì)通過(guò)TNF-α系統(tǒng)誘導(dǎo)壁顆粒細(xì)胞(MGCs)凋亡,從而損傷卵母細(xì)胞的發(fā)育能力卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究驗(yàn)證束縛應(yīng)激與CRH升高是否通過(guò)TNF-α系統(tǒng)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力、MGCs與卵母細(xì)胞的凋亡情況以及TNF-α系統(tǒng)的激活來(lái)探究束縛應(yīng)激通過(guò)TNF-α系統(tǒng)損傷卵母細(xì)胞發(fā)育能力的機(jī)制。在卵母細(xì)胞未成熟時(shí)給予束縛應(yīng)激,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,束縛應(yīng)激后,小鼠囊胚率與囊胚細(xì)胞數(shù)均顯著下降,卵母細(xì)胞及壁顆粒細(xì)胞的凋亡比例顯著增加,血清、卵巢及壁顆粒細(xì)胞中的TNF-α與TNFR1蛋白表達(dá)量均顯著升高。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)壁顆粒細(xì)胞,CRH處理組壁顆粒細(xì)胞的TNF-α與TNFR1蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡比例均顯著升高,而同時(shí)添加CRH及其拮抗劑antalarmin后,壁顆粒細(xì)胞中TNF-α與TNFR1蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡比例與添加CRH組相比均顯著下降,CRH的損傷作用被逆轉(zhuǎn)。通過(guò)體內(nèi)敲除TNF-α、注射TNF-α拮抗劑etanercep以及RNAi技術(shù)體外敲低TNF-α均可顯著減輕束縛應(yīng)激及CRH對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力和凋亡及MGCs凋亡的不利影響。結(jié)果表明束縛應(yīng)激及CRH的升高可以通過(guò)激活TNF-α系統(tǒng)影響卵母細(xì)胞的發(fā)育能力,且可采用TNF-α拮抗劑來(lái)改善心理應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞的不利影響。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：S852.2
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文23圖3-1束縛應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞中Bcl-2、Bax表達(dá)的影響Figure3-1EffectsofrestraintstressonBcl-2/Baxlevelsinoocyte注：束縛時(shí)間為48h，圖A：Bcl-2mRNA水平；圖B：BaxmRNA水平；圖C：Bcl-2/Bax比值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a,b:表中每列字母相同表示差異未達(dá)顯著水平（p>0.05），不同則表示差異達(dá)到顯著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.A,relativeBcl-2mRNA;B,relativeBaxmRNA;C,relativeBcl-2/BaxmRNAEachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上圖可知，與對(duì)照組相比，束縛48h后，Bcl-2mRNA水平顯著降低，BaxmRNA水平顯著升高，且Bcl-2/Bax比值對(duì)照組顯著高于束縛組。其中Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因，結(jié)果表明，束縛應(yīng)激后，小鼠卵母細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組。即束縛應(yīng)激影響凋亡基因表達(dá)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡。3.3束縛應(yīng)激對(duì)TNF-α系統(tǒng)的影響由于束縛應(yīng)激導(dǎo)致卵巢細(xì)胞的凋亡率顯著升高，為了驗(yàn)證束縛應(yīng)激通過(guò)激活TNF-α系統(tǒng)導(dǎo)致卵巢細(xì)胞凋亡，進(jìn)而損傷的卵母細(xì)胞發(fā)育能力這一實(shí)驗(yàn)猜想，我們通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)，首先檢測(cè)了TNF-α系統(tǒng)是否被激活。ABC

束縛應(yīng)激與CRH升高通過(guò)激活TNF-α系統(tǒng)損傷小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育能力243.3.1束縛應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞中TNFR1表達(dá)的影響上述實(shí)驗(yàn)證明束縛應(yīng)激損傷卵母細(xì)胞發(fā)育能力且誘導(dǎo)卵母細(xì)胞凋亡，因此首先檢測(cè)卵母細(xì)胞中TNF-α系統(tǒng)是否被激活。收集GV期卵母細(xì)胞，加入RIPA裂解液，用WesternBlot檢測(cè)TNFR1的表達(dá)情況。每個(gè)處理重復(fù)3次，每組重復(fù)對(duì)照組與束縛組各約240個(gè)卵母細(xì)胞。圖3-2束縛應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞中TNFR1表達(dá)的影響（體內(nèi)）Figure3-2EffectsofrestraintstressonTNFR1proteinofoocyte(invivo)由上圖可知，對(duì)照組相對(duì)蛋白表達(dá)量為1，束縛組相對(duì)蛋白表達(dá)量為1.80。與對(duì)照組相比，束縛應(yīng)激后小鼠卵母細(xì)胞中的TNFR1水平顯著升高（P<0.05），即束縛應(yīng)激激活卵母細(xì)胞中的TNF-α系統(tǒng)。3.3.2束縛應(yīng)激對(duì)血清中TNF-α表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)共用18只小鼠，對(duì)照組與束縛組各9只，每3只充分混合組成一個(gè)樣本。用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中TNF-α的表達(dá)量。

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文25圖3-3束縛應(yīng)激對(duì)血清中TNF-α表達(dá)的影響Figure3-3EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinserum注：束縛時(shí)間為48h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a,b:表中每列字母相同表示差異未達(dá)顯著水平（p>0.05），不同則表示差異達(dá)到顯著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上圖可知，對(duì)照組血清中的TNF-α表達(dá)量為26.92pg/mL，束縛48h后TNF-α表達(dá)量為47.36pg/mL。與對(duì)照組相比，束縛應(yīng)激后小鼠血清中的TNF-α水平顯著升高（P<0.05）。3.3.3束縛應(yīng)激對(duì)卵巢勻漿中TNF-α表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)共用18只小鼠，對(duì)照組與束縛組各9只，每3只充分混合組成一個(gè)樣本。用ELISA試劑盒檢測(cè)卵巢勻漿中TNF-α的表達(dá)量。圖3-4束縛應(yīng)激對(duì)卵巢勻漿中TNF-α表達(dá)的影響Figure3-4EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinovary注：束縛時(shí)間為48h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。a,b:表中每列字母相同表示差異未達(dá)顯著水平（p>0.05），不同則表示差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(P<0.05)
【參考文獻(xiàn)】

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1 趙書(shū)濤;武曉東;王策;陳永勤;唐玉國(guó);;流式細(xì)胞儀的原理、應(yīng)用及最新進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年22期

2 Bencomo E.;Pérez R.;ArteagaM.-F.;A. Palumbo;馬超;;胰島素樣生長(zhǎng)因子I降低黃體顆粒細(xì)胞凋亡,與胚胎破碎和妊娠率相關(guān)[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè));2006年Z1期

本文編號(hào)：2882589