隨著社會的發(fā)展,生活節(jié)奏的加快,人們承受的心理壓力越來越大,心理應激會造成雌性生殖障礙,導致不孕,流產等各種疾病。束縛應激是最經典的心理應激模型之一。研究表明束縛應激會激活HPA(下丘腦-垂體-腎上腺)軸,并導致血清和卵巢中促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotrophin-releasing Hormone,CRH)含量升高從而誘導壁顆粒細胞凋亡,但其機制尚不清楚。實驗室前期研究表明CRH水平升高通過Fas/FasL系統(tǒng)誘導壁顆粒細胞及卵母細胞的凋亡;但FasL突變的gld小鼠實驗中,也存在束縛應激誘導細胞凋亡,這表明束縛應激可能激活除Fas/FasL系統(tǒng)以外的其他通路。TNF-α系統(tǒng)同樣可以誘導多種組織和細胞的凋亡,但應激過程中CRH是否也會通過TNF-α系統(tǒng)誘導壁顆粒細胞(MGCs)凋亡,從而損傷卵母細胞的發(fā)育能力卻未見報道。本研究驗證束縛應激與CRH升高是否通過TNF-α系統(tǒng)影響卵母細胞的發(fā)育能力。通過體內、體外實驗檢測小鼠卵母細胞發(fā)育能力、MGCs與卵母細胞的凋亡情況以及TNF-α系統(tǒng)的激活來探究束縛應激通過TNF-α系統(tǒng)損傷卵母細胞發(fā)育能力的機制。在卵母細胞未成熟時給予束縛應激,體內實驗結果表明,束縛應激后,小鼠囊胚率與囊胚細胞數(shù)均顯著下降,卵母細胞及壁顆粒細胞的凋亡比例顯著增加,血清、卵巢及壁顆粒細胞中的TNF-α與TNFR1蛋白表達量均顯著升高。體外實驗結果表明,培養(yǎng)壁顆粒細胞,CRH處理組壁顆粒細胞的TNF-α與TNFR1蛋白表達量和細胞凋亡比例均顯著升高,而同時添加CRH及其拮抗劑antalarmin后,壁顆粒細胞中TNF-α與TNFR1蛋白表達量和細胞凋亡比例與添加CRH組相比均顯著下降,CRH的損傷作用被逆轉。通過體內敲除TNF-α、注射TNF-α拮抗劑etanercep以及RNAi技術體外敲低TNF-α均可顯著減輕束縛應激及CRH對卵母細胞發(fā)育能力和凋亡及MGCs凋亡的不利影響。結果表明束縛應激及CRH的升高可以通過激活TNF-α系統(tǒng)影響卵母細胞的發(fā)育能力,且可采用TNF-α拮抗劑來改善心理應激對卵母細胞的不利影響。
【學位單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S852.2
【部分圖文】：

山東農業(yè)大學碩士專業(yè)學位論文23圖3-1束縛應激對卵母細胞中Bcl-2、Bax表達的影響Figure3-1EffectsofrestraintstressonBcl-2/Baxlevelsinoocyte注：束縛時間為48h，圖A：Bcl-2mRNA水平；圖B：BaxmRNA水平；圖C：Bcl-2/Bax比值。每組實驗重復3次。a,b:表中每列字母相同表示差異未達顯著水平（p>0.05），不同則表示差異達到顯著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.A,relativeBcl-2mRNA;B,relativeBaxmRNA;C,relativeBcl-2/BaxmRNAEachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上圖可知，與對照組相比，束縛48h后，Bcl-2mRNA水平顯著降低，BaxmRNA水平顯著升高，且Bcl-2/Bax比值對照組顯著高于束縛組。其中Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因，結果表明，束縛應激后，小鼠卵母細胞凋亡率顯著高于對照組。即束縛應激影響凋亡基因表達，導致卵母細胞凋亡。3.3束縛應激對TNF-α系統(tǒng)的影響由于束縛應激導致卵巢細胞的凋亡率顯著升高，為了驗證束縛應激通過激活TNF-α系統(tǒng)導致卵巢細胞凋亡，進而損傷的卵母細胞發(fā)育能力這一實驗猜想，我們通過以下實驗來檢驗，首先檢測了TNF-α系統(tǒng)是否被激活。ABC

束縛應激與CRH升高通過激活TNF-α系統(tǒng)損傷小鼠卵母細胞的發(fā)育能力243.3.1束縛應激對卵母細胞中TNFR1表達的影響上述實驗證明束縛應激損傷卵母細胞發(fā)育能力且誘導卵母細胞凋亡，因此首先檢測卵母細胞中TNF-α系統(tǒng)是否被激活。收集GV期卵母細胞，加入RIPA裂解液，用WesternBlot檢測TNFR1的表達情況。每個處理重復3次，每組重復對照組與束縛組各約240個卵母細胞。圖3-2束縛應激對卵母細胞中TNFR1表達的影響（體內）Figure3-2EffectsofrestraintstressonTNFR1proteinofoocyte(invivo)由上圖可知，對照組相對蛋白表達量為1，束縛組相對蛋白表達量為1.80。與對照組相比，束縛應激后小鼠卵母細胞中的TNFR1水平顯著升高（P<0.05），即束縛應激激活卵母細胞中的TNF-α系統(tǒng)。3.3.2束縛應激對血清中TNF-α表達的影響實驗共用18只小鼠，對照組與束縛組各9只，每3只充分混合組成一個樣本。用ELISA試劑盒檢測血清中TNF-α的表達量。

山東農業(yè)大學碩士專業(yè)學位論文25圖3-3束縛應激對血清中TNF-α表達的影響Figure3-3EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinserum注：束縛時間為48h。每組實驗重復3次。a,b:表中每列字母相同表示差異未達顯著水平（p>0.05），不同則表示差異達到顯著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上圖可知，對照組血清中的TNF-α表達量為26.92pg/mL，束縛48h后TNF-α表達量為47.36pg/mL。與對照組相比，束縛應激后小鼠血清中的TNF-α水平顯著升高（P<0.05）。3.3.3束縛應激對卵巢勻漿中TNF-α表達的影響實驗共用18只小鼠，對照組與束縛組各9只，每3只充分混合組成一個樣本。用ELISA試劑盒檢測卵巢勻漿中TNF-α的表達量。圖3-4束縛應激對卵巢勻漿中TNF-α表達的影響Figure3-4EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinovary注：束縛時間為48h。每組實驗重復3次。a,b:表中每列字母相同表示差異未達顯著水平（p>0.05），不同則表示差異達到顯著水平（P<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(P<0.05)
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 趙書濤;武曉東;王策;陳永勤;唐玉國;;流式細胞儀的原理、應用及最新進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2011年22期

2 Bencomo E.;Pérez R.;ArteagaM.-F.;A. Palumbo;馬超;;胰島素樣生長因子I降低黃體顆粒細胞凋亡,與胚胎破碎和妊娠率相關[J];世界核心醫(yī)學期刊文摘(婦產科學分冊);2006年Z1期

本文編號：2882589