蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)植物在我國(guó)有39種,目前對(duì)其區(qū)分主要以形態(tài)鑒定為主。DNA條形碼鑒定是一種新型的物種鑒定方法,是利用基因組中一段相對(duì)較短的片段對(duì)物種進(jìn)行鑒定的分子技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)探究對(duì)花椒屬植物不同材料樣本DNA提取方法的優(yōu)化,使用DNA條形碼鑒定方法對(duì)花椒屬9種植物共121份樣本使用ITS2序列進(jìn)行鑒定研究,旨在使用分子鑒定的手段準(zhǔn)確地對(duì)花椒屬植物進(jìn)行鑒定,并嘗試使用ITS2序列對(duì)花椒(Z. Bungeanum)及竹葉花椒(Z. armatum)種內(nèi)的不同品種進(jìn)行鑒定。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：(1)使用在DNA提取中較為常見(jiàn)的兩種方法CTAB法及試劑盒法,對(duì)本次實(shí)驗(yàn)采集的花椒屬121份樣本進(jìn)行提取與改良,結(jié)果表明,兩種方法對(duì)新鮮葉片及經(jīng)過(guò)硅膠干燥葉片材料的DNA提取均能獲得成功,果皮類材料經(jīng)過(guò)改良提取方法：在加入DNA提取液之前,使用核分離液洗滌3次,水浴時(shí)間1h,也能成功提取DNA。兩種方法均能獲得符合PCR要求的總DNA。PC后電泳檢測(cè)條帶明亮、單一,其樣本經(jīng)測(cè)序、序列拼接及注釋剪切后共獲得121條ITS2序列。(2)使用ITS2片段對(duì)花椒屬植物進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明ITS2序列能夠有效鑒定本次實(shí)驗(yàn)收集的花椒屬9種植物,除花椒Z. Bungeanum以外,8種植物的種內(nèi)最大K2P距離均小于與其余物種間的種間最小K2P距離,可以明顯與其余物種進(jìn)行區(qū)分。各物種在ITS2序列中有穩(wěn)定區(qū)別于其他8個(gè)物種的位點(diǎn),可作為鑒別花椒屬9種植物的輔助手段,能將花椒屬9種植物進(jìn)行良好地區(qū)分。鄰接(NJ)法構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹(shù),各物種均能各自聚為一支,能較好地與其他物種較好地區(qū)分開(kāi)。(3)在使用ITS2序列對(duì)花椒及竹葉花椒的品種進(jìn)行鑒定時(shí),花椒種內(nèi)4個(gè)品種中,漢源花椒、越西貢椒及靈山正路椒ITS2序列一致,無(wú)法使用ITS2序列進(jìn)行鑒定區(qū)分,但來(lái)自四川松潘、茂縣、汶川的花椒樣本與甘肅禮縣、臨夏、天水的花椒樣本在3個(gè)位點(diǎn)上一致表現(xiàn)出與其余產(chǎn)地花椒樣本的差異。竹葉花椒種內(nèi)3個(gè)品種在ITS2序列上并無(wú)穩(wěn)定、明顯差異。DNA條形碼技術(shù)能夠準(zhǔn)確、快速地對(duì)花椒屬9種植物進(jìn)行鑒定。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S573.9
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 花椒屬植物研究現(xiàn)狀
        1.1.1 花椒屬植物概述
        1.1.2 花椒的化學(xué)成分及藥理作用
        1.1.3 花椒屬植物的誤用問(wèn)題
        1.1.4 花椒屬植物鑒定研究
        1.1.5 花椒的品種
        1.1.6 花椒屬植物DNA提取方法
    1.2 DNA條形碼技術(shù)
        1.2.1 DNA條形碼的定義
        1.2.2 DNA條形碼鑒定方法及原理
        1.2.3 DNA條形碼的應(yīng)用歷史
        1.2.4 植物DNA條形碼的篩選
        1.2.5 DNA條形碼鑒定方法的特點(diǎn)
        1.2.6 ITS2序列
        1.2.7 ITS2序列在中藥材鑒定方面的應(yīng)用
2 研究目的及意義
3 研究?jī)?nèi)容與方法
    3.1 研究材料
    3.2 研究?jī)?nèi)容
    3.3 研究方法
        3.3.1 DNA提取方法探究
        3.3.2 ITS2序列擴(kuò)增
        3.3.3 峰圖質(zhì)量評(píng)價(jià)與拼接
        3.3.4 ITS2序列驗(yàn)證
        3.3.5 種間種內(nèi)變異分析及鄰接樹(shù)圖的建立
4 結(jié)果與分析
    4.1 DNA提取方法
    4.2 凝膠電泳檢測(cè)
    4.3 序列拼接及序列驗(yàn)證
    4.4 種內(nèi)種間變異分析
    4.5 各物種單倍型及變異位點(diǎn)分析
    4.6 花椒及竹葉花椒種內(nèi)品種間變異分析
    4.7 種間ITS2序列聚類分析
5 討論
    5.1 花椒屬植物提取方法
    5.2 ITS2序列對(duì)花椒屬植物的鑒定能力
    5.3 ITS2序列對(duì)品種的鑒定能力
    5.4 花椒屬分類的討論
6 主要結(jié)論
7 本實(shí)驗(yàn)的不足與展望
8 參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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