鴨疫里默氏桿菌感染(Riemerella anatipestifer infection)是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一,主要感染鴨、鵝等多種禽類的接觸性傳染疾病,又稱為鴨傳染性漿膜炎。該病是由黃桿菌科里默氏桿菌屬的鴨疫里默氏桿菌引起的,感染鴨會出現(xiàn)生長緩慢,消瘦,飼料轉(zhuǎn)化率降低,肉品質(zhì)下降,及高死亡率等癥狀,在養(yǎng)殖和疾病的治療等方面給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。目前確認(rèn)的鴨疫里默氏桿菌的血清型至少有21個,公布在GenBank上的就有9株鴨疫里默氏桿菌的全基因序列。鴨疫里默氏桿菌的編碼基因超過2000個,而目前已研究的只有其中的極少數(shù)。現(xiàn)階段控制鴨疫里默氏桿菌病的主要方法是注射疫苗和抗菌性藥物,而絕大部分鴨疫里默氏桿菌菌株對卡那霉素有抗藥性,因此本研究通過構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌的轉(zhuǎn)座子隨機突變庫,來篩選和鑒定鴨疫里默氏桿菌對卡那霉素耐藥相關(guān)的基因。試驗一是根據(jù)鴨疫里默氏桿菌CH3株dnaB基因和16S rRNA的序列設(shè)計引物,構(gòu)建了雙重PCR檢測方法。采用方陣法對雙重PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行優(yōu)化改造,優(yōu)化的反應(yīng)退火溫度為60℃。試驗結(jié)果表明,該新型雙重PCR技術(shù)能準(zhǔn)確檢驗鴨疫里默氏桿菌,對檢測的所有不同血清型鴨疫里默氏桿菌菌株均能擴增出364 bp和627 bp兩條特異的目的片段,而對鴨致病性大腸桿菌、鴨源禽巴氏桿菌、腸炎沙門氏菌、黃桿菌等對照菌株的擴增結(jié)果均為陰性;該PCR方法對細(xì)菌HXb2基因組DNA和菌液的檢測敏感性分別為17.33 ng/mL DNA和2.9×103CFU/mL細(xì)菌。利用建立的雙重PCR檢測了鴨疫里默氏桿菌感染鴨的肝臟和腦組織中的鴨疫里默氏桿菌,結(jié)果顯示該方法與細(xì)菌分離法符合率分別為100%(9/9)和77.8%(7/9),表明本試驗建立的雙重PCR方法可用于檢測肝臟組織中鴨疫里默氏桿菌。本研究建立的雙重PCR方法既可以對分離的鴨疫里默氏桿菌疑似菌株進行快速檢測和鑒定,也可以直接用于臨床樣品中鴨疫里默氏桿菌的檢測。試驗二是鴨疫里默氏桿菌分離株的卡那霉素藥敏試驗。試驗選取了貴州大學(xué)送檢的17株鴨疫里默氏桿菌,進行雙重PCR鑒定、血清學(xué)鑒定和藥敏試驗。結(jié)果表明,這些分別屬于1、2、5和15型鴨疫里默氏桿菌;且所有分離自貴州大學(xué)不同血清型的鴨疫里默氏桿菌菌株都對卡那霉素耐受。此外,本實驗室常用的鴨疫里默氏桿菌如CH3、HXb2、Yb2和WJ4等也均對卡那霉素耐受。試驗三是將鴨疫里默氏桿菌的Yb2株為受體菌,將質(zhì)粒pEP4351轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW19851,構(gòu)建得到BW19851(pEP4351)作為供體菌,通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的濾膜接合轉(zhuǎn)移法技術(shù)將質(zhì)粒pEP4351導(dǎo)入受體菌鴨疫里默氏桿菌Yb2株中,使轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機插入鴨疫菌株的基因組中。由于Tn4351上有紅霉素抗性基因和Yb2對多黏菌素耐藥,通過微量肉湯稀釋法測定鴨疫和大腸桿菌BW19851對紅霉素和多黏菌素的最小抑菌濃度(MIC),以紅霉素0.3μg/mL和多粘菌素125μg/mL進行陽性接合子的篩選。構(gòu)建的隨機突變庫,通過卡那霉素抗性實驗來對突變株進行篩選,初步尋找到鴨疫卡那霉素抗性減弱的突變株,對突變株的最小抑菌濃度進行檢驗,以確定突變株是否對卡那霉素失去耐藥性或耐藥明顯減弱。對驗證后的突變株結(jié)果觀察,篩選到了卡那霉素耐藥性明顯減弱的突變株DK-2。采用基因組步移法擴增測定轉(zhuǎn)座子的插入位點在核糖體50S的L27亞基。PCR擴增野生株的50S L27基因ORF,連入大腸桿菌-鴨疫里默式桿菌穿梭表達載體pRES51,得到互補質(zhì)粒pRES-50S-L27,然后通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將互補質(zhì)粒導(dǎo)入突變株DK-2中,通過紅霉素和多黏菌素抗性篩選和PCR檢測鑒定,得到了互補菌株cDK-2。然后測定野生株、突變株和互補株的生長曲線和藥敏試驗。結(jié)果表明,野生株、突變株及其基因互補株的生長曲線差異不大;但DK-2的MIC比野生株Yb2和cDK-2低8倍左右。回復(fù)株cDK-2和野生株Yb2的卡那霉素藥敏片直徑為0,對kana是耐受的;而突變株DK-2的卡那霉素藥敏片直徑為10mm,表現(xiàn)對kana有低度敏感。另外,與野生株Yb2和互補株cDK-2相比,突變株DK-2對新霉素和利福平等抗生素的敏感性也增加�？傊�,本研究通過構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌Yb2株的Tn4351隨機突變中,篩選到了與卡那霉素耐藥性相關(guān)的基因50S L27。本研究對進一步研究鴨疫里默氏桿菌50S核糖體及50S L27亞基的功能等奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

采用本實驗中設(shè)計的引物用 PCR 分別擴增 16S rRNA 和 danB，結(jié)果顯示，所有的鴨疫里默氏桿菌都擴增出與預(yù)期片段大小一致的目的條帶，16S rRNA 基因在退度為 57℃、59℃擴增效率最高；danB 基因在 53℃-59℃擴增效率均很高(圖 2)。

圖 3 雙重 PCR 的特異性試驗結(jié)果Fig3 The specificity of duplex PCRNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～16：依次為鴨疫里默氏桿菌菌株 P2123、D26220、D743、NJ-1 等； 21～36：依次氏桿菌菌株 Yb2、YXb12、Y-1、NN-1 等； 17～20 分別為黃桿菌 FJ-1、多殺性巴氏桿菌 CVCC486、多殺性

圖 4 鴨疫里默氏桿菌基因組 DNA 和菌液作為模板時雙重 PCR 的敏感性試驗g 4 The sensitivity of duplex PCR using the genomic DNAand boiled bacteria of R. anatipestifer as templates分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～9：鴨疫里默氏桿菌菌液的稀釋倍數(shù)分別為 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、1DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 10～17：基因組 DNA 的稀釋度分別為 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7
【參考文獻】

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本文編號：2872624