植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一直存在的重大問題,它可以直接導(dǎo)致全球糧食作物和其余的農(nóng)產(chǎn)品減產(chǎn)近20%。植物病原真菌是很常見的病原菌,很容易侵染植物,造成農(nóng)作物的低產(chǎn),因此對植物病害的防治是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展道路的重要環(huán)節(jié)。輪枝鐮刀菌作為水稻立枯病、玉米穗腐病、茄子枯萎病、番茄枯萎病等枯萎真菌病害的致病菌,嚴重制約了農(nóng)作物的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)。目前,對于植物病害的防治措施主要以使用化學(xué)農(nóng)藥為主,但是化學(xué)農(nóng)藥給環(huán)境和人類帶來了一定的安全隱患,農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境、打破生態(tài)平衡、使病原菌抗藥性增強等問題逐漸凸顯。生物防治因其與環(huán)境友好,與非靶標(biāo)菌友好等特點引起了人們的關(guān)注,并且成為了新型農(nóng)藥研究的主要方向。放線菌作為微生物中產(chǎn)活性物質(zhì)最高的一類菌群,其活性代謝產(chǎn)物被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域,具有很大的發(fā)掘價值。本研究利用前期從河西走廊疏勒河流域鹽堿土壤中分離篩選出的10株拮抗放線菌,篩選對輪枝鐮刀菌等多種植物病原真菌有拮抗作用的放線菌,優(yōu)化菌株發(fā)酵條件,探索其穩(wěn)定性,并且從放線菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化出有效活性代謝產(chǎn)物,對其進行活性及抑菌機理研究,以期為下一步生物農(nóng)藥的開發(fā)等研究提供基礎(chǔ),具體結(jié)果如下:1.利用常見的6種放線菌生長培養(yǎng)基對實驗室前期已有的10株放線菌進行最優(yōu)培養(yǎng)基的選擇,確定A12211在高氏一號培養(yǎng)基上產(chǎn)孢情況最好;4-3-5,221,B2-304在Isp_2培養(yǎng)基上產(chǎn)孢情況最好;4-2-1在Isp_3培養(yǎng)基上產(chǎn)孢情況最好;B2-202在Isp_4培養(yǎng)基上產(chǎn)孢情況最好;DA4-3-12,DA8-4-10,DA8-3-15,16-3-10在Ms培養(yǎng)基上產(chǎn)孢情況最好。2.采用瓊脂擴散法,以常見的六種植物病原菌為靶標(biāo)菌,對長勢較好的7株放線菌進行初篩,菌株DA4-3-12對六種植物病原真菌均具有抑制作用,且對輪枝鐮刀菌的抑制效果最好;以輪枝鐮刀菌為靶標(biāo)菌,利用瓊脂擴散法對7株放線菌在不同發(fā)酵時間下的抑菌活性進行復(fù)篩,結(jié)果表明,菌株DA4-3-12產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的能力最強且最穩(wěn)定,所以確定菌株DA4-3-12為后續(xù)的目標(biāo)菌株。3.采用單因素和正交試驗對菌株DA4-3-12進行液體發(fā)酵條件優(yōu)化,結(jié)果表明,菌株DA4-3-12最優(yōu)發(fā)酵條件:接種量7%,發(fā)酵時間156 h,起始pH11,裝液量90/250 mL。優(yōu)化后菌株DA4-3-12的抑菌圈直徑達到了3.40 cm。4.采用瓊脂擴散法測定不同條件對菌株DA4-3-12發(fā)酵上清液抑菌活性穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明,不同溫度、貯存時間、紫外照射時間、酸堿條件、蛋白酶條件下發(fā)酵液上清的抑菌活性均具有穩(wěn)定性,對金屬離子不穩(wěn)定,在后期試驗、保存、運輸過程中應(yīng)該注意避免接觸含鐵、銅、鋅、鋁的各種容器,以免影響發(fā)酵液抑菌活性。5.對菌株DA4-3-12發(fā)酵上清液活性成分理化性質(zhì)研究結(jié)果表明,該抑菌活性物質(zhì)可以溶于氯仿等有機溶劑;利用草酸沉淀和丙酮沉淀法處理發(fā)酵液后沉淀均無抑菌活性,證明該抑菌活性物質(zhì)為非蛋白類物質(zhì);菌株DA4-3-12發(fā)酵液經(jīng)過大孔吸附樹脂處理后,不僅可以對發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進行分離,還可以增強發(fā)酵液抑菌活性。6.以活性跟蹤法為指導(dǎo)思想,采用瓊脂擴散法,利用離心、大孔吸附樹脂、硅膠柱層析等分離方法對菌株DA4-3-12的發(fā)酵活性物質(zhì)進行分離除雜后,用制備型高效色譜儀對樣品進行純化,獲得了一種抑菌活性物質(zhì)A1,分子量為1354.8,推測化合物的化學(xué)式為C_(62)H_(117)N_9O_(23),結(jié)合質(zhì)譜分析及文獻調(diào)研,初步確定該物質(zhì)為新型活性物質(zhì)。7.采用顯微觀察等方法研究菌株DA4-3-12發(fā)酵液活性提取物的抑菌機理發(fā)現(xiàn),用菌株DA4-3-12發(fā)酵液粗提物處理病原菌輪枝鐮刀菌120 h后,病原菌菌絲的生長、孢子的產(chǎn)生均受到抑制,孢子停止萌發(fā);發(fā)酵液活性物質(zhì)粗提物對病原菌的菌絲及孢子的形態(tài)均有影響,經(jīng)處理后,菌絲有斷裂、膨脹、畸形等變化,孢子形態(tài)呈不規(guī)則的線狀、隔斷消失,表面有皰疹狀突起;同時病原菌細胞膜通透性也發(fā)生了變化,說明該活性物質(zhì)對病原菌的細胞膜產(chǎn)生了損害。
【學(xué)位單位】：西北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S476
【部分圖文】：

第4章拮抗菌株DA4-3-12抑菌活性產(chǎn)物的分離純化35圖4-1菌株DA4-3-12發(fā)酵液去蛋白處理后的生測圖Fig.4-1BioassayofdeproteinizedfermentationbrothofstrainDA4-3-12A:發(fā)酵濾液B:調(diào)酸后上清液C:加丙酮后上清液D:丙酮E:調(diào)酸后沉淀F:加丙酮后沉淀A:Fermentationbroth;B:Addacidandsupernatant;C:Supernatantwithacetone;D:Acetone;E:Aftertheacidprecipitation;F:Acetoneisaddedtoprecipitate;如表4-4和圖4-1所示，菌株DA4-3-12發(fā)酵液經(jīng)過草酸調(diào)酸和丙酮處理后的上清液都具有生物活性，調(diào)酸和丙酮處理后的沉淀均沒有生物活性。結(jié)果表明發(fā)酵液在經(jīng)過調(diào)酸和丙酮處理兩個過程可以除去大量雜蛋白，活性物質(zhì)損失少，表明該活性物質(zhì)是非蛋白，這為活性物質(zhì)的進一步純化提供了基矗4.3.2大孔吸附樹脂HP-20對發(fā)酵產(chǎn)物的分離及影響菌株DA4-3-12的液體發(fā)酵經(jīng)過添加大孔吸附樹脂HP-20處理后（圖4-2），結(jié)果表明，發(fā)酵上清液無抑菌活性，大孔吸附樹脂經(jīng)甲醇洗脫后的旋蒸提取物有抑菌活性，說明大孔吸附樹脂對抑菌活性物質(zhì)有吸附作用，可以通過在發(fā)酵液中添加大孔吸附樹脂對抑菌活性物質(zhì)進行分離。另外，經(jīng)過大孔吸附樹脂處理后的抑菌活性較不含有大孔吸附樹脂的發(fā)酵液的抑菌活性有明顯增強，可能是因為添加大孔吸附樹脂后避免了產(chǎn)物抑制，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。大孔吸附樹脂的添加量對抑菌活性也有明顯的影響，如圖4-3所示，隨著大孔吸附樹脂添加量的增加，呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢，當(dāng)大孔吸附樹脂的添加量為7%時，抑菌圈直徑最大，抑菌活性最強。如表4-5所示，在對發(fā)酵液中的大孔吸附樹脂用不同濃度甲ABCDEFABCDEF

第4章拮抗菌株DA4-3-12抑菌活性產(chǎn)物的分離純化36醇洗脫劑進行洗脫后，只有經(jīng)過濃度為100%的甲醇洗脫劑洗脫后的有機相濃縮物有抑菌活性，其余濃度的甲醇洗脫劑均未表現(xiàn)出抑菌活性，后期的分離過程中可采用分析純甲醇對活性物質(zhì)進行洗脫。圖4-2大孔吸附樹脂對菌株DA4-3-12發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的分離、增強效果Fig.4-2EffectofadsorptionresinonisolationandEnhanceofbacteriostaticactivesubstancesinthefermentationbrothofstrainDA4-3-12A：添加樹脂后的發(fā)酵濾液；B：樹脂的甲醇洗脫物；C：未添加樹脂的發(fā)酵濾液；A:fermentationfiltrateafteraddingresin;B:methanoleluentoftheresinC:fermentationfiltratewithoutaddingresin;035792.52.62.72.82.93.0bcbab抑菌圈直徑Diameterofbacteriostaticzone/cm樹脂添加量Resincontent/g圖4-3大孔吸附樹脂添加量對菌株DA4-3-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4-3EffectoftheadditionofmacroporousadsorbentresinontheantibacterialactivityofthefermentationbrothofstrainDA4-3-12ABCB

第4章拮抗菌株DA4-3-12抑菌活性產(chǎn)物的分離純化38圖4-5DA4-3-12發(fā)酵液氯仿萃取后的結(jié)果Fig.4-5ResultsofchloroformextractionfromDA4-3-12fermentationbrothA：氯仿處理；B：有機相；C：發(fā)酵液；D：水相A:Chloroformtreatment;B:Organicphase;C:Fermentationbroth;D:Aqueousphas4.3.4硅膠柱層析分離結(jié)果用不同極性的洗脫劑對樣品洗脫后，表現(xiàn)出了不同的抑菌效果（表4-6），結(jié)果顯示，石油醚為洗脫劑時，1-8瓶的平均抑菌圈直徑為1.3cm，9-10瓶無抑菌效果；洗脫劑為二氯甲烷時，第7瓶的抑菌圈直徑為1.2cm；當(dāng)洗脫劑為二氯甲烷：乙酸乙酯=1:1時，抑菌圈直徑為1.0cm；當(dāng)乙酸乙酯為洗脫劑時，1-4瓶的平均抑菌圈直徑為1.5cm，5-8瓶的平均抑菌圈直徑為1.0cm，第9瓶時，抑菌圈直徑為1.7cm；當(dāng)洗脫劑為丙酮時，第8瓶表現(xiàn)出抑菌活性為3.1cm；當(dāng)洗脫劑為甲醇時，從第1瓶到第8瓶都表現(xiàn)出了很好的抑菌活性，其中第2瓶時抑菌活性最強達到4.7cm，總體上呈現(xiàn)出了先增大后減小的趨勢,其余的洗脫產(chǎn)物都沒有抑菌活性；最后確定該抑菌活性物質(zhì)可被不同洗脫劑洗脫下來，但是甲醇洗脫下來的F2為主要的活性組分，最終收集甲醇洗脫后的第二瓶樣品，旋蒸后保存?zhèn)溆�，命名為WN001。ACDB
【參考文獻】

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本文編號：2872711