玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)主要是由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種廣泛存在于谷物和糧食作物中的真菌毒素。它的衍生物有多種,常見的有5種。ZEN能對糧食造成污染問題,并對動物具有雌激素作用,給養(yǎng)殖業(yè)帶來一系列的經(jīng)濟(jì)損失。因此,建立一種快速,簡便,特異的檢測方法十分必要。本研究制備了ZEN人工抗原,對動物進(jìn)行免疫后通過細(xì)胞融合技術(shù)篩選出ZEN mAb,建立了ZEN免疫試紙檢測方法。為我國食品安全檢測和糧食中ZEN的殘留檢測提供了技術(shù)支持。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:1將ZEN分子進(jìn)行化學(xué)修飾,引入能與載體蛋白偶聯(lián)的基團(tuán)(-COOH)合成酯ZEN-CMO,采用混合酸酐法(MA)將半抗原ZEN-CMO與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián),合成抗原ZEN-BSA;通過羧甲基羥胺半鹽酸鹽與ZEN產(chǎn)生肟化反應(yīng)對ZEN分子進(jìn)行修飾,合成酯ZEN-CMO,采用碳二亞胺法(EDC)與載體蛋白雞血清白蛋白(OVA)偶聯(lián)合成包被抗原。對人工抗原ZEN-BSA進(jìn)行理化性質(zhì)檢測,經(jīng)紫外(UV),紅外(IR),蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定,檢測結(jié)果顯示,人工抗原合成成功;將ZEN-BSA對4周齡雌性Balb/C小鼠進(jìn)行免疫,制備多克隆抗體(pAb),經(jīng)ELISA檢測免疫小鼠pAb的效價(jià)達(dá)到1︰2.56×10~5,間接ELISA檢測半數(shù)抑制濃度IC_(50)值為38.9 ng/mL,與α-ZER,α-ZOL的交叉反應(yīng)率為100%,與β-ZER的交叉反應(yīng)率為30%,與ZAN的交叉反應(yīng)率為20%,與β-ZOL的交叉反應(yīng)率為10%。與AFB1,ABG1,ABG2,DON,T-2,FB1等其他真菌毒素沒有交叉反應(yīng)。2將合成的人工抗原ZEN-BSA免疫雌性Balb/C小鼠,采用間接ELISA和間接競爭ELISA檢測,挑選細(xì)胞融合備用小鼠。利用細(xì)胞融合技術(shù)將3號小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在PEG-1500的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合,篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株制備ZEN mAb,并對其免疫特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:細(xì)胞融合后,篩選出三株雜交瘤細(xì)胞株分別將其命名為1B12,3A5,4G10。其中,3A5株最好,對三株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行核型鑒定,獲得的3株雜交瘤細(xì)胞株染色體的數(shù)目平均是98.7條。通過體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生腹水法制備出的抗體具有較高的效價(jià),經(jīng)9次傳代培養(yǎng)抗體分泌穩(wěn)定,細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)是1︰128,腹水抗體效價(jià)是1︰5.12×10~5,IC_(50)為7.93 ng/mL�？�100%識別ZEN,與α-ZER、α-ZOL、β-ZER、β-ZOL、ZAN的交叉反應(yīng)率分別為100%、100%、22.91%、16.28%、9.42%。3A5株雜交瘤細(xì)胞分泌的ZEN mAb的親和常數(shù)為6.79×10~9 L/mol,說明該株雜交瘤細(xì)胞株親和力高。制備出了效價(jià)高、敏感性好、特異性強(qiáng)的ZEN mAb,為ZEN免疫試紙檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。3利用ZEN單克隆抗體3A5制備了ZEN icELISA試劑盒,通過對試劑盒進(jìn)行優(yōu)化后,線性回歸方程曲線良好,回歸方程為y=-41.014x+111.14,R~2=0.9809,IC_(50)是30.9 ng/mL,檢測范圍是5.75~165.96 ng/mL。具有良好的準(zhǔn)確度及精密度,可室溫保存一年及以上。采用檸檬酸三鈉還原法以氯金酸為材料制備膠體金,采用Mey氏系列穩(wěn)定法對抗體進(jìn)行標(biāo)記,建立ZEN膠體金免疫試紙的檢測方法。經(jīng)紫外(UV)和透射電鏡掃描后,檢測結(jié)果表明,膠體金的粒徑為25±1.0 nm,說明該膠體金制備成功;確定ZEN mAb的最佳標(biāo)記濃度是4.5μg/mL;成功研制出ZEN免疫膠體金試紙條(ZEN-Strip),ZEN-Strip具有快速(5-10 min)、靈敏(3.91 ng/mL)、特異(只與ZEN反應(yīng),與其他生物毒素?zé)oCR)、廣譜(可同時(shí)檢測其衍生物α-ZER、β-ZER、α-ZOL、β-ZOL、ZAN)、簡便(不需其他儀器與試劑)等優(yōu)勢,具有良好的市場應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。
【學(xué)位單位】：河南科技學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S859.8
【部分圖文】：

第二章ZEN的檢測技術(shù)研究進(jìn)展133.3細(xì)胞傳感器細(xì)胞傳感器因響應(yīng)迅速和靈敏度高等優(yōu)勢而在食品安全檢測具備一定的研究意義，它在生物傳感器的研究過程中有著重要的地位，其原理是是將固定或未固定的活細(xì)胞與轉(zhuǎn)換原件組合成的生物傳感器。微生物檢測的實(shí)現(xiàn)是在代謝過程中產(chǎn)生電子后，通過信號傳遞媒介在電極上放電，產(chǎn)生可被檢測的信號，實(shí)現(xiàn)微生物的檢測。JI等[82]建立了由鐮刀菌產(chǎn)生的生物毒素ZEN，檢測限是3.2ng/mL，具有較好的檢測效果。4小結(jié)以上理化性質(zhì)檢測方法和免疫學(xué)檢測方法均可完成ZEN的檢測，然而在對ZEN的多種檢測方法中，考慮到檢測樣品的準(zhǔn)確性、靈敏性和方便快捷等特點(diǎn)，相較于ZEN當(dāng)前的污染現(xiàn)狀，免疫學(xué)檢測技術(shù)具有極大的優(yōu)勢，是實(shí)現(xiàn)ZEN快速檢測的主要技術(shù)。因此，制備出高質(zhì)量的ZEN-mAb，建立ZEN免疫試紙的檢測是十分必要的，該方法建立的同時(shí)也為我國食品安全檢測提供重要的技術(shù)支持。技術(shù)路線如圖2-1。圖2-1技術(shù)路線圖Fig.2-1TechnologyRoadmap

玉米赤霉烯酮及其衍生物單克隆抗體的制備及免疫試紙檢測方法的建立223.3人工抗原SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖3-5所示，在相同條件下，BSA較ZEN-BSA的遷移速度快，說明ZEN-BSA比ZEN的分子質(zhì)量大，證明抗原合成成功。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測，ZEN-BSA分子量為70569.3，BSA分子量為66430。經(jīng)計(jì)算，ZEN-BSA與ZEN偶聯(lián)比為1︰13。注：1Marker；2BSA;3ZEN-BSANote:1Marker;2BSA;3ZEN-BSA圖3-5人工抗原ZEN-BSA的SDS-PAGE鑒定Fig.3-5SDS-PAGEidentificationofartificialantigenZEN-BSA3.4pAb間接競爭ELISA結(jié)果小鼠血清抗體的效價(jià)如表3-1、表3-2所示，經(jīng)ELISA檢測，5只小鼠的效價(jià)均達(dá)到1︰6.4×103，其中馬血清封閉液檢測抗體效價(jià)最高達(dá)到1︰2.56×105，豬血清封閉液檢測抗體效價(jià)最高達(dá)到1︰1.28×104，豬血清封閉液陰性、空白檢測值均高于馬血清封閉液，豬血清封閉液本底值較高，由此可見，馬血清封閉液的封閉效果更好，故本實(shí)驗(yàn)選用馬血清作為封閉液。

第五章ZEN免疫檢測試紙方法的建立及初步應(yīng)用43圖5-1ZENStrip結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5-1ZENStripstructurediagram2.8ZEN膠體金免疫試紙的性能測定2.8.1敏感性配制ZEN標(biāo)準(zhǔn)品母液濃度為62.5μg/L，31.25μg/L，15.63μg/L，7.82μg/L，3.91μg/L，1.96μg/L，0.98μg/L，0.49μg/L，0μg/L。用ZEN-Strip進(jìn)行測定，根據(jù)試紙條的檢測限，用肉眼觀察T線的顯色情況，來判斷檢測結(jié)果的敏感性。2.8.2重復(fù)性設(shè)置ZEN標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度：高濃度（15μg/L）、中濃度（10μg/L）、低濃度（5μg/L）和空白對照（0μg/L）。取4批不同批次的ZEN-Strip，在不同的時(shí)間對其濃度進(jìn)行檢測，確定其重復(fù)性。2.8.3符合度從不同的途徑收集玉米，飼料和小麥樣品各15份。用ZEN-Strip和HPLC-MS/MS檢測其符合率。樣品前處理操作步驟同第四章。2.8.4保存期ZEN-Strip在4℃條件下保存，定期（30d）檢驗(yàn)ZEN-Strip在空白反應(yīng)液中的顯色情況，檢測結(jié)果與第一次檢測時(shí)的顯色情況相比較，如果顯色結(jié)果變淺，則該試紙條失效。此為ZEN-Strip有效期。
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本文編號：2860313