本文關(guān)鍵詞：稻瘟病抗性相關(guān)基因OsOGCP、OsDXR和OsRPA3α的克隆與功能初步分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是世界上重要的糧食作物之一。發(fā)掘抗病基因,培育持久抗病的水稻新品種始終是一大研究熱點(diǎn)。本論文在粳稻云引受稻瘟病菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上,篩選出可能與水稻稻瘟病抗性相關(guān)的3個(gè)基因,分別是(1)編碼線粒體載體蛋白的AK068090(暫時(shí)命名為OsOGCP);(2)編碼1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸鹽還原異構(gòu)酶的AF367205(暫時(shí)命名為OsDXR);(3)編碼含OB-fold結(jié)構(gòu)域的核酸結(jié)合蛋白的AK070400(暫時(shí)命名為OsRPA3a)。為了進(jìn)一步確定這3個(gè)基因的功能,我們選用廣譜抗稻瘟病品種云引和普感品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)為材料,分別從云引和LTH中克隆了這3個(gè)基因并進(jìn)行初步功能分析。主要研究結(jié)果如下：1.分別以云引和麗江新團(tuán)黑谷葉片的cDNA為模板,擴(kuò)增3個(gè)目的基因的CDS和啟動(dòng)子序列。序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因OsOGCP、OsDXR和OsRPA3a的CDS序列以及基因OsRPA3a的啟動(dòng)子序列各自在云引和麗江新團(tuán)黑谷兩個(gè)品種中完全一致,而且與NCBI中登錄的序列相同；基因OsOGCP和OsDXR的啟動(dòng)子序列在云引和麗江新團(tuán)黑谷兩個(gè)品種中同源性分別為95.98%和98.78%。2.利用RACE技術(shù)分別獲得3個(gè)目的基因的cDNA全長(zhǎng)序列,然后利用MEGA5.1分別構(gòu)建相應(yīng)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),初步分析和預(yù)測(cè)這3個(gè)基因可能具有的功能,其中OsOGCP基因與禾本科黍?qū)倬幋aα-酮戊二酸載體蛋白的基因親緣關(guān)系較近,且位于同一分支上；OsDXR基因與姜屬編碼1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶的基因有較近的親緣關(guān)系；OsRPA3a基因與玉米屬中編碼逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白的基因親緣關(guān)系較近。3.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析這3個(gè)目的基因在受稻瘟病菌誘導(dǎo)后不同時(shí)間段的表達(dá)情況。結(jié)果表明,隨著接種稻瘟病菌時(shí)間的推移,3個(gè)基因的表達(dá)量也發(fā)生相應(yīng)的變化,說(shuō)明這3個(gè)基因的表達(dá)受稻瘟病菌誘導(dǎo)。4.分別構(gòu)建了這3個(gè)目的基因的植物過(guò)表達(dá)載體、RNAi干擾表達(dá)載體和植物亞細(xì)胞定位載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入云引中,從而獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株,為后期的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：粳稻 云引 稻瘟病 基因克隆 載體構(gòu)建 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.111.41
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一章 緒論11-19
• 1.1 研究背景11-12
• 1.2 稻瘟病研究進(jìn)展12-14
• 1.2.1 稻瘟病抗性基因的遺傳學(xué)研究12
• 1.2.2 稻瘟病抗性基因的定位和克隆研究12-14
• 1.3 相關(guān)候選基因研究進(jìn)展14-16
• 1.3.1 α-酮戊二酸/蘋果酸載體蛋白研究14
• 1.3.2 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶研究14-15
• 1.3.3 DNA復(fù)制蛋白A的研究15-16
• 1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR16
• 1.5 RACE技術(shù)16-17
• 1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化17
• 1.7 研究目的及意義17-19
• 第二章 候選基因表達(dá)量分析19-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 2.1.1 植物材料和菌株19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 2.2.1 材料準(zhǔn)備19-20
• 2.2.1.1 水稻幼苗的種植19
• 2.2.1.2 稻瘟病菌的活化、培養(yǎng)及孢子懸浮液的配制19-20
• 2.2.1.3 水稻幼苗接種和葉片采集20
• 2.2.2 目的基因mRNA序列的獲得20
• 2.2.3 水稻葉片總RNA的提取20-21
• 2.2.4 cDNA的合成21-22
• 2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)22
• 2.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)22-23
• 2.3 結(jié)果與分析23-26
• 2.3.1 水稻幼苗接種稻瘟病菌“四川-43”23-24
• 2.3.2 水稻總RNA的鑒定24
• 2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析24-26
• 2.4 討論26-27
• 第三章 候選基因的克隆及序列分析27-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 3.1.1 植物材料27
• 3.1.2 主要試劑27
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 3.2.1 候選基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增27-30
• 3.2.1.1 提取葉片總RNA27
• 3.2.1.2 cDNA的獲得27
• 3.2.1.3 引物設(shè)計(jì)27-28
• 3.2.1.4 目的片段擴(kuò)增及回收28-29
• 3.2.1.5 目的片段與pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector連接29
• 3.2.1.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞29-30
• 3.2.1.7 測(cè)序及序列分析30
• 3.2.2 候選基因非編碼區(qū)序列的擴(kuò)增30-33
• 3.2.2.1 提取云引和麗江新團(tuán)黑谷葉片總RNA30
• 3.2.2.2 cDNA的合成30-31
• 3.2.2.3 候選基因RACE引物設(shè)計(jì)31
• 3.2.2.4 目的基因5'UTR及3'UTR的擴(kuò)增及回收31-32
• 3.2.2.5 目的片段與pEASYTM-Blunt Cloning Vector連接及轉(zhuǎn)化32
• 3.2.2.6 測(cè)序及序列分析32-33
• 3.2.3 候選基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增33-35
• 3.2.3.1 葉片總DNA的提取33
• 3.2.3.2 啟動(dòng)子序列引物設(shè)計(jì)33-34
• 3.2.3.3 啟動(dòng)子序列擴(kuò)增及回收34
• 3.2.3.4 目的片段與pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector連接34
• 3.2.3.5 測(cè)序及序列分析34-35
• 3.2.4 云引和麗江新團(tuán)黑谷OsOGCP和OsDXR基因組序列的擴(kuò)增35-36
• 3.2.4.1 基因組序列引物設(shè)計(jì)35
• 3.2.4.2 基因組序列擴(kuò)增35
• 3.2.4.3 目的片段與pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector連接35
• 3.2.4.4 測(cè)序及序列分析35-36
• 3.3 結(jié)果與分析36-41
• 3.3.1 云引和麗江新團(tuán)黑谷中目的基因編碼區(qū)序列克隆和比對(duì)36-37
• 3.3.2 云引中候選基因5'和3'非編碼區(qū)序列擴(kuò)增37-38
• 3.3.3 云引和麗江新團(tuán)黑谷中候選基因啟動(dòng)子克隆及序列比對(duì)38-40
• 3.3.4 候選基因OsOGCP和OsDXR基因組結(jié)構(gòu)分析40-41
• 3.3.5 目的基因的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分析41
• 3.4 討論41-43
• 第四章 候選基因植物過(guò)量表達(dá)載體、亞細(xì)胞定位載體和干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化43-60
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.1.1 菌株和質(zhì)粒43
• 4.1.2 植物材料43
• 4.1.3 主要試劑43
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法43-52
• 4.2.1 候選基因過(guò)量表達(dá)載體和亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建43-48
• 4.2.1.1 目的基因酶切位點(diǎn)分析43
• 4.2.1.2 帶酶切位點(diǎn)的目的基因的擴(kuò)增43-45
• 4.2.1.3 目的片段與pEASy~(TM)-Blunt Cloning Vector連接及轉(zhuǎn)化45
• 4.2.1.4 目的片段測(cè)序及序列分析45
• 4.2.1.5 雙酶切含目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒及pCAMBIA1302空載體45-47
• 4.2.1.6 目的片段與pCAMBIA1302載體的連接47
• 4.2.1.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與鑒定47
• 4.2.1.8 過(guò)表達(dá)載體凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌47-48
• 4.2.2 候選基因RNAi干擾表達(dá)載體的構(gòu)建48-52
• 4.2.2.1 帶酶切位點(diǎn)的目的基因的擴(kuò)增及回收48-50
• 4.2.2.2 目的片段與pEASY~(TM)-Blunt Cloning Vector連接及轉(zhuǎn)化50
• 4.2.2.3 目的片段測(cè)序及序列分析50
• 4.2.2.4 RNAi干擾中間載體構(gòu)建50-51
• 4.2.2.5 候選基因RNAi干擾表達(dá)載體第二聯(lián)構(gòu)建51-52
• 4.2.2.6 RNAi干擾表達(dá)載體凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV310152
• 4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化52-53
• 4.4 結(jié)果與分析53-59
• 4.4.1 植物過(guò)量表達(dá)載體和亞細(xì)胞定位載體的獲得53-56
• 4.4.2 植物干擾表達(dá)載體的獲得56-58
• 4.4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化58-59
• 4.5 討論59-60
• 第五章 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 附錄69-78
• 致謝78

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本文編號(hào)：283531