本文關(guān)鍵詞：遼寧絨山羊蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)基因（PLP2）的表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：遼寧絨山羊是我國特有的禁止基因外流的寶貴遺傳資源,產(chǎn)絨量居全國第一。在前期工作中,我們通過建庫及Primer walking質(zhì)粒測通的方法克隆篩選出蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)基因(proteolipid protein 2,PLP2)的全長序列。為了探究該基因的功能,我們對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析(包括預(yù)測其開放閱讀框,親疏水性分析、跨膜預(yù)測分析、信號肽預(yù)測分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、進(jìn)化樹的構(gòu)建、多重序列的比對、保守結(jié)構(gòu)域搜索),Real-time PCR,RT-PCR,原位雜交以及Noggin基因干擾慢病毒感染后目的基因的qPCR檢測等的一系列分析研究。分析結(jié)果顯示:首先,通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)PLP2基因能夠編碼含有152個氨基酸的蛋白質(zhì),二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,PLP2基因含有α螺旋結(jié)構(gòu)(46.05%)、延伸結(jié)構(gòu)(12.5%)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(41.45%),功能位點(diǎn)分析顯示,PLP2含有MARVEL結(jié)構(gòu)域并且存在4個跨膜區(qū),不存在信號肽,PLP2氨基酸含有3個Ser、2個Tyr和1個Thr可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn);其次,通過RT-PCR檢測顯示,PLP2基因在皮膚、心臟、肝臟、腎臟、肺、脾臟中均有表達(dá),且表達(dá)差異不是很明顯,其中皮膚中的表達(dá)含量相對較高;同時,還運(yùn)用了熒光定量PCR技術(shù),定量的檢測其在不同時期的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在興盛期時,PLP2基因在次級毛囊的表達(dá)量約為初級毛囊的1.02倍(0.01P0.05),在退行期時,PLP2基因的表達(dá)量仍是次級毛囊高于初級毛囊,是初級毛囊的1.16倍(0.01P0.05);另外,經(jīng)過原位雜交分析,發(fā)現(xiàn)PLP2基因在內(nèi)根鞘有表達(dá),而在外根鞘、毛干(角質(zhì)層、皮層和髓層)以及毛囊乳突中無表達(dá);最后,通過Noggin基因干擾后PLP2基因的qPCR檢測,顯示空白組的表達(dá)量是NC陰性對照的1.15倍,而noggin干擾后PLP2的表達(dá)量是NC陰性對照組的0.64倍。結(jié)論:(1)PLP2基因在皮膚、心臟、肝臟、腎臟、肺、脾臟各個組織中都有表達(dá),這說明PLP2與各臟器相關(guān)功能無直接聯(lián)系;(2)PLP2基因在興盛期和退行期中的表達(dá)量均是次級毛囊高于初級毛囊,這說明PLP2基因?qū)q毛細(xì)度有一定的調(diào)節(jié)作用;(3)PLP2基因僅在內(nèi)根鞘中有所表達(dá),推測PLP2基因可能和絨毛脫落有關(guān)。(4)noggin基因干擾后,PLP2的表達(dá)量下降,這說明PLP2基因連同noggin基因等其他通路中的抑制基因一起,可能會對BMP通路有一定的影響,進(jìn)而影響毛囊的發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：遼寧絨山羊 PLP2 生物信息學(xué)分析 熒光定量PCR Noggin基因干擾慢病毒
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 引言8
• 1 背景概述8-12
• 1.1 遼寧絨山羊8
• 1.2 BMP及BMP信號通路8-9
• 1.3 PLP基因和PLP2基因及其研究進(jìn)展9-10
• 1.4 研究的目的及意義10-12
• 2 PLP2基因的序列分析12-24
• 2.1 PLP2全長序列測定12-13
• 2.1.1 primer walking測序方法12
• 2.1.2 結(jié)果12-13
• 2.2 PLP2生物信息學(xué)分析13-24
• 2.2.1 方法13-14
• 2.2.2 結(jié)果14-22
• 2.2.3 討論22-24
• 3 PLP2基因在遼寧絨山羊毛囊不同生長時期的表達(dá)研究24-41
• 3.1 實(shí)驗材料24
• 3.2 試劑及儀器24-25
• 3.2.1 實(shí)驗試劑24
• 3.2.2 實(shí)驗儀器24-25
• 3.3 方法25-32
• 3.3.1 初、次級毛囊的分離25
• 3.3.2 初、次級毛囊總RNA提取25-26
• 3.3.3 總RNA的檢測26
• 3.3.4 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)26-27
• 3.3.5 半定量RT-PCR檢測27-29
• 3.3.6 熒光定量PCR反應(yīng)29-30
• 3.3.7 原位雜交30-32
• 3.4 實(shí)驗結(jié)果32-39
• 3.4.1 RNA提取32-33
• 3.4.2 RT-PCR33-36
• 3.4.3 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗結(jié)果36-38
• 3.4.4 原位雜交實(shí)驗結(jié)果38-39
• 3.5 討論39-41
• 4 Noggin基因干擾后PLP2基因的表達(dá)檢測41-50
• 4.1 實(shí)驗材料及主要實(shí)驗儀器41-42
• 4.1.1 實(shí)驗材料41
• 4.1.2 主要實(shí)驗儀器41-42
• 4.2 實(shí)驗步驟42-44
• 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)42
• 4.2.2 Noggin基因干擾病毒及陰性對照腺病毒感染目的細(xì)胞42
• 4.2.3 總RNA的抽提42
• 4.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA42-43
• 4.2.5 qPCR引物設(shè)計43
• 4.2.6 qPCR實(shí)驗43-44
• 4.3 實(shí)驗結(jié)果44-49
• 4.3.1 病毒感染前后細(xì)胞圖片44-45
• 4.3.2 預(yù)實(shí)驗qPCR產(chǎn)物電泳圖45-46
• 4.3.3 正式實(shí)驗qPCR產(chǎn)物電泳圖46-47
• 4.3.4 qPCR數(shù)據(jù)分析47-49
• 4.4 討論49-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 附錄A 原位雜交實(shí)驗試劑配制方法56-57
• 附錄B 不同時期 β-actin、PLP2基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線圖57-61
• 附錄C Noggin基因干擾后PLP2基因及內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線61-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況62-63
• 致謝63

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