本文關(guān)鍵詞：兩個hpal_x基因轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株及其轉(zhuǎn)化子功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HAB-5菌株是本實驗室從棉花土壤根際中分離得到的一株短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis),具有廣譜的抑菌效果。hpalxoo和hpaXm基因分別來自水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和棉花角斑病菌(X. citri subsp. Malvacearum nov.comb. nov. nom. nov.),編碼抗病激活蛋白harpinX,本研究利用化學(xué)方法將hpalxoo和hpaXm基因分別轉(zhuǎn)化至野生型HAB-5菌株中,以期能實現(xiàn)harpin蛋白在短短芽孢桿菌內(nèi)的高效表達(dá),構(gòu)建更高效穩(wěn)定的生防菌株,為新型生物農(nóng)藥的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下： 1.將hpalxoo及hpaXm基因轉(zhuǎn)化HAB-5菌株,48h后在Amp抗性平板上得到了陽性轉(zhuǎn)化子,其中,共獲得轉(zhuǎn)入hpalxoo的轉(zhuǎn)化子有581個,轉(zhuǎn)入hpaXm的轉(zhuǎn)化子有650個。經(jīng)PCR和PCR Southern Blot研究證實,目的基因hpaXm和hpalxoo已插入轉(zhuǎn)化子中。 2.在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72h后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子菌株菌落形態(tài)均發(fā)生了一定程度上的改變。經(jīng)對峙培養(yǎng)后,各轉(zhuǎn)化子菌株對芒果炭疽病菌C7-2菌株均有不同程度的抑制作用,但相對于HAB-5菌株,目前所篩選到的轉(zhuǎn)化子菌株拮抗活性都減弱。 3.分別從hpalXoo和hpaXm轉(zhuǎn)化子中選取代表性轉(zhuǎn)化子B3xm和B5xoo,經(jīng)SDS-PAGE電泳,供測試的轉(zhuǎn)化子,在分子量大小約為39kD和41kD處均出現(xiàn)明顯的條帶,說明融合蛋白GST-HarpinXm和GST-HarpinXoo在轉(zhuǎn)化子菌株中得到表達(dá)。 4.將GST-HarpinXoo粗蛋白、GST-HarpinXm粗蛋白,轉(zhuǎn)化子B3xm粗蛋白及B5xoo粗蛋白注射煙草葉片,18h后均能在煙草葉片上激發(fā)過敏性反應(yīng)(HR),而野生型HAB-5菌株粗蛋白不能激發(fā)HR；且轉(zhuǎn)化子表達(dá)的harpin蛋白對酸堿不敏感,對熱穩(wěn)定,對紫外線和蛋白酶K敏感,與現(xiàn)已報道HarpinXoo、HarpinXm特性相同。 5.采用室內(nèi)發(fā)芽試驗法測定野生型菌株HAB-5、轉(zhuǎn)化子B3xm及B5xoo三個菌株的菌懸液和發(fā)酵液對番茄種子生長的作用,結(jié)果表明,除HAB-5菌株1×109cfu/ml濃度外,各菌株各不同濃度的菌懸液對番茄種子的生長均有促進(jìn)作用,其中,野生型HAB-5菌株菌懸液對胚芽和胚根的生長最適促生效果為34.6%和36.0%,相比于HAB-5菌株,轉(zhuǎn)化子菌株B3xm、B5xoo菌懸液對胚芽和胚根的生長促進(jìn)均有了明顯的提高,尤其是B3xm菌株菌懸液,對胚芽和胚根生長的最適促生效果為100.8%和69.1%。經(jīng)各菌株高濃度發(fā)酵液處理后的番茄種子不能發(fā)芽,對發(fā)芽勢和發(fā)芽率的抑制作用為100%；將各菌株發(fā)酵液稀釋10倍后,對種子發(fā)芽過程的抑制作用已基本解除,但對胚芽和胚根的生長仍有抑制作用；而當(dāng)各菌株發(fā)酵液稀釋到50倍后,對種子發(fā)芽的抑制作用已完全解除,還能明顯促進(jìn)胚芽和胚根的生長,且倆轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵液較野生型HAB-5菌株發(fā)酵液對胚芽和胚根的促進(jìn)作用均有所提高,尤其是B3xm菌株發(fā)酵液,對胚芽和胚根的最適促生效果為54.5%和38.1%。 6.采用針刺法研究野生型菌株HAB-5、轉(zhuǎn)化子B3xm及B5xoo三個菌株的菌懸液和發(fā)酵液對離體葉片上芒果炭疽菌株C7-2侵染的防治效果,結(jié)果顯示,各菌株各個不同濃度的菌懸液對病原菌C7-2都有不同程度的抑制作用,且轉(zhuǎn)化子B3xm及B5xoo菌株菌懸液較野生型HAB-5菌株的菌懸液在芒果葉片上對C7-2的抑制作用均有所增強；通過各菌株發(fā)酵液、發(fā)酵液稀釋10倍及發(fā)酵液稀釋50倍處理后,發(fā)現(xiàn)各組均對C7-2病原菌具有顯著的抑制效果,且經(jīng)各菌株發(fā)酵液稀釋10倍處理后,對C7-2菌株的拮抗效果最好；此外,經(jīng)轉(zhuǎn)化子B3xm菌株發(fā)酵液和發(fā)酵液稀釋10倍處理組后的實驗組,比同組野生型HAB-5菌株對C7-2菌株的抑制作用均有所提高。 7.由于高濃度HAB-5菌懸液或發(fā)酵液具有抑制植物(番茄)種子發(fā)芽的趨勢,這可能與生長素類物質(zhì)分泌有關(guān),因此,利用生長素極性運輸抑制劑(TIBA)對生長素(IAA)極性運輸?shù)囊种谱饔迷?在菌株培養(yǎng)過程中加入不同濃度的TIBA,結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入不同濃度TIBA后的高濃度菌懸液對種子生長的抑制作用均被成功解除,還能對胚芽和胚根的生長有不同程度的促進(jìn)作用,其中,含0.5mg/L TIBA的菌懸液為最適濃度,能最大程度上促進(jìn)番茄種子的生長；而同樣加入了不同濃度TIBA與菌株共培養(yǎng)的菌株發(fā)酵液,卻對番茄種子的生長仍有抑制作用；此外,實驗過程中還發(fā)現(xiàn),經(jīng)LB培養(yǎng)基處理組的番茄種子不能發(fā)芽,對番茄種子的生長有顯著的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：hpa_(Xm) ha1_(Xoo) 轉(zhuǎn)化 短短芽孢桿菌HAB-5
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 目錄8-12
• 一、引言12-23
• 1. hrp基因及其編碼的harpin蛋白12-16
• 1.1 hrp基因和harpin蛋白12-13
• 1.2 Harpin蛋白在植物上的功能13-14
• 1.2.1 誘導(dǎo)植物抗病13-14
• 1.2.2 促進(jìn)植物生長發(fā)育和誘導(dǎo)植物抗蟲14
• 1.2.3 誘導(dǎo)植株耐旱14
• 1.3 Harpin激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)14-16
• 1.3.1 過敏性反應(yīng)(HR)15
• 1.3.2 氧爆發(fā)15
• 1.3.3 其他防衛(wèi)反應(yīng)15-16
• 1.4 Harpin蛋白的表達(dá)系統(tǒng)16
• 2. 短短芽孢桿菌及其遺傳改良16-21
• 2.1 短短芽孢桿菌的生物特性16-17
• 2.2 短短芽孢桿菌的抑菌作用及其機制17-18
• 2.2.1 對病原菌的抑制作用17
• 2.2.2 短短芽孢桿菌的抑菌作用機制17-18
• 2.3 短短芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)18-19
• 2.3.1 短桿菌肽18
• 2.3.2 短桿菌酪肽18-19
• 2.3.3 其它抗菌物質(zhì)19
• 2.4 短短芽孢桿菌在國內(nèi)外的研究及其應(yīng)用19-20
• 2.4.1 對植物的促生作用19
• 2.4.2 保鮮作用19
• 2.4.3 微生物降解19-20
• 2.4.4 其他方面20
• 2.4.5 短短芽孢桿菌的防病作用20
• 2.5 短短芽孢桿菌的遺傳改良20-21
• 2.5.1 短短芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)20-21
• 2.5.2 芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法21
• 3. 生長素的極性運輸抑制劑(TIBA)21-22
• 4. 本研究意義22-23
• 二、材料與方法23-34
• 1. 材料23-24
• 1.1 供試菌株23
• 1.2 供試菌株材料23
• 1.3 培養(yǎng)基23-24
• 1.4 主要試劑24
• 2. 方法24-34
• 2.1 質(zhì)粒提取24-25
• 2.2 hpa1_(Xoo)及hpa_(Xm)基因轉(zhuǎn)入HAB-5菌株25
• 2.3 引物設(shè)計與合成25-26
• 2.4 目的基因的PCR驗證26
• 2.5 切膠回收26-27
• 2.6 克隆轉(zhuǎn)化及測序27
• 2.7 HAB-5及其轉(zhuǎn)化子菌株菌落形態(tài)和對C7-2菌株的平板拮抗作用測定27-28
• 2.7.1 菌株菌落形態(tài)觀察27
• 2.7.2 對芒果炭疽菌C7-2菌株的平板拮抗作用27-28
• 2.8 粗蛋白的提取方法28
• 2.9 SDS-PAGE電泳28-29
• 2.10 煙草過敏性反應(yīng)(HR)29
• 2.11 轉(zhuǎn)化子粗蛋白特性的研究29-30
• 2.11.1 轉(zhuǎn)化子粗蛋白熱穩(wěn)定性測定29
• 2.11.2 轉(zhuǎn)化子粗蛋白耐酸堿性測定29
• 2.11.3 轉(zhuǎn)化子粗蛋白對胰蛋白酶和蛋白酶K穩(wěn)定性的測定29
• 2.11.4 轉(zhuǎn)化子粗蛋白紫外線敏感性測定29-30
• 2.12 菌懸液和發(fā)酵液的配置30
• 2.13 短短芽孢桿菌HAB-5及其轉(zhuǎn)化子菌株對番茄種子的促生作用測定30
• 2.13.1 對番茄種子的促生作用30
• 2.13.2 TIBA對抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用30
• 2.14 對芒果炭疽離體葉片的拮抗效果30-31
• 2.15 PCR Southern Blot31-34
• 2.15.1 目的基因的PCR31
• 2.15.2 探針制備方法31
• 2.15.3 試劑配制31
• 2.15.4 洗膠和轉(zhuǎn)膜31-32
• 2.15.5 預(yù)雜交和雜交32
• 2.15.6 洗膜和顯色32-34
• 三、結(jié)果與分析34-57
• 1. 轉(zhuǎn)化子菌株的篩選及PCR驗證34-36
• 2. PCR Southern Blot驗證36-37
• 2.1 目的基因的PCR擴增36
• 2.2 探針的制備和標(biāo)記36-37
• 2.3 PCR Southern Blot37
• 3. 菌落形態(tài)對比37-38
• 4. 轉(zhuǎn)化子對炭疽病菌株C7-2拮抗作用38-40
• 5. 轉(zhuǎn)化子harpin蛋白的表達(dá)40
• 6. 轉(zhuǎn)化子粗蛋白能激發(fā)煙草產(chǎn)生過敏性反應(yīng)并具有harpin蛋白的特性40-41
• 7. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株菌懸液對番茄種子的促生效果41-45
• 8. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株菌懸液對芒果炭疽離體葉片的拮抗作用45-48
• 9. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵液對番茄種子的促生作用48-51
• 10. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵液對芒果炭疽離體葉片的拮抗效果51-53
• 11. TIBA對抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用53-57
• 11.1 TIBA對HAB-5菌懸液抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用53-54
• 11.2 TIBA對HAB-5發(fā)酵液抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用54-57
• 四、討論57-59
• 五、結(jié)論59-60
• 六、創(chuàng)新點60-61
• 七、參考文獻(xiàn)61-67
• 已發(fā)表論文67
• 課題來源67-68
• 致謝68

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  本文關(guān)鍵詞：兩個hpal_x基因轉(zhuǎn)化短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevs）HAB-5菌株及其轉(zhuǎn)化子功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：276401