本文關(guān)鍵詞：藍(lán)舌病病毒1型衣殼蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：為了探究藍(lán)舌病(Bluetongue, BT)亞單位疫苗以及血清學(xué)檢測(cè)方法,本研究從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了探索：1. 培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞大量繁殖1型藍(lán)舌病病毒(BTV1)病毒液,利用蔗糖密度梯度離心從培養(yǎng)的病毒液中分離純化BTV1,將純化的BTV1滅活與弗氏完全佐劑混合乳化,免疫兔子和綿羊制備BTV多克隆抗體。2. Trizol法從BTV1病毒液提取總RNA,設(shè)計(jì)引物RT-PCR克隆BTV1的四個(gè)衣殼蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因,將克隆的目的基因插入pMD18-T載體,構(gòu)建克隆載體TVP2、TVP3、 TVP5、TVP7。3.對(duì)克隆載體TVP2、TVP3、TVP5、TVP7和pFastBac HTB載體經(jīng)雙酶切,得到VP2、VP3、VP5、VP7基因和線性化的pFastBac HTB載體；再將四個(gè)衣殼蛋白基因插入線性化的pFastBac HTB載體,獲得重組轉(zhuǎn)座載體pVP2、pVP3、pVP5、pVP7;重組轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)化E.coli DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得重組桿粒rVP2、rVP3、rVP5、rVP7;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲得重組桿狀病毒,用其感染Sf9細(xì)胞,分別通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況及其生物活性,進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)和純化。4. 利用表達(dá)的VP7重組蛋白,及前期制備的兔抗BTV多克隆抗體和綿羊抗BTV多克隆抗體,初步建立了藍(lán)舌病抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。研究結(jié)果顯示：1. 純化得到了BTV1,免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體效價(jià)均在1：1024以上2. 克隆的BTV1的四個(gè)衣殼蛋白VP2、VP3、VP5、VP7基因,大小依次為2886bp、2706bp、1581 bp、1050bp,與預(yù)期的結(jié)果相一致。3. 重組的桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后,經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析,表達(dá)的四個(gè)蛋白的大小依次為115 ku、107 ku、61ku、38 ku,能夠與BTV1陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。4. 用建立的抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)86份樣品進(jìn)行檢測(cè),其檢測(cè)結(jié)果與國(guó)家蟲(chóng)媒病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的檢測(cè)試劑盒相比,結(jié)果完全符合。但是,由于檢測(cè)的樣品數(shù)量有限,還需要檢測(cè)大量的田間樣品來(lái)對(duì)檢測(cè)方法的特異性和敏感性進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)舌病病毒 衣殼蛋白 表達(dá) 競(jìng)爭(zhēng)ELISA
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-19
• 1.1 藍(lán)舌病概述11
• 1.2 藍(lán)舌病病毒病原學(xué)研究11-12
• 1.3 藍(lán)舌病疫苗的研究進(jìn)展12-17
• 1.3.1 傳統(tǒng)藍(lán)舌病疫苗12-14
• 1.3.2 新型藍(lán)舌病疫苗14-17
• 1.4 總結(jié)與展望17-19
• 第二章 BTV1多克隆抗體的制備與衣殼蛋白基因的克隆19-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 毒株、動(dòng)物19
• 2.1.2 菌種、載體、細(xì)胞19
• 2.1.3 主要試劑19-20
• 2.1.4 主要儀器20
• 2.1.5 主要溶液和培養(yǎng)基的配置20-21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-25
• 2.2.1 BTV1的細(xì)胞培養(yǎng)21
• 2.2.2 BTV1病毒粒子的純化與鑒定21-22
• 2.2.3 BTV1多克隆抗體的制備22
• 2.2.4 BTV1 VP2、VP3、VP5、VP7基因引物的設(shè)計(jì)與合成22
• 2.2.5 BTV1 RNA的提取22-23
• 2.2.6 RT-PCR克隆目的基因23
• 2.2.7 目的基因的純化回收23-24
• 2.2.8 目的基因與pMD18-T載體的連接24
• 2.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化24
• 2.2.10 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定24-25
• 2.2.11 陽(yáng)性質(zhì)粒的提取25
• 2.2.12 陽(yáng)性質(zhì)粒的測(cè)序25
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果25-29
• 2.3.1 純化BTV病毒粒子的SDS-PAGE鑒定25-26
• 2.3.2 衣殼蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增26-28
• 2.3.3 BTV衣殼蛋白基因的克隆載體的鑒定28-29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 BTV1衣殼蛋白的真核表達(dá)與活性鑒定31-48
• 3.1 試驗(yàn)材料31-33
• 3.1.1 菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞31
• 3.1.2 主要試劑31-32
• 3.1.3 主要儀器32
• 3.1.4 主要溶液和培養(yǎng)基的配置32-33
• 3.2 試驗(yàn)方法33-39
• 3.2.1 感受態(tài)的制備33
• 3.2.2 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pVP2、pVP3、pVP5與pVP7的構(gòu)建及鑒定33-35
• 3.2.3 重組桿粒rVP2、rVP3、rVP5與rVP7的構(gòu)建與鑒定35-36
• 3.2.4 重組桿粒的精提取36-37
• 3.2.5 Sf9細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)37
• 3.2.6 Sf9細(xì)胞的馴化37
• 3.2.7 Sf9細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)37-38
• 3.2.8 重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞38
• 3.2.9 重組桿狀病毒的收獲與培養(yǎng)38
• 3.2.10 重組蛋白的SDS-PAGE與Western blotting分析38-39
• 3.2.11 重組蛋白VP7的表達(dá)與純化39
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果39-46
• 3.3.1 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒菌液PCR鑒定39-41
• 3.3.2 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的雙酶切鑒定41-42
• 3.3.3 重組桿粒的PCR鑒定42-44
• 3.3.4 重組桿粒濃度測(cè)定44
• 3.3.5 重組桿狀轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞結(jié)果44
• 3.3.6 重組蛋白的SDS-PAGE分析44-45
• 3.3.7 重組蛋白的Western-blot分析45-46
• 3.3.8 純化重組VP7蛋白的SDS-PAGE分析46
• 3.4 討論46-48
• 第四章 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立48-52
• 4.1 試驗(yàn)材料48
• 4.1.1 血清48
• 4.1.2 主要試劑48
• 4.1.3 主要儀器48
• 4.2 試驗(yàn)方法48-50
• 4.2.1 樣品血清的抗體檢測(cè)48-49
• 4.2.2 試劑最佳工作濃度的滴定49
• 4.2.3 競(jìng)爭(zhēng)ELISA的試驗(yàn)步驟49-50
• 4.2.4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA的結(jié)果判定50
• 4.3 試驗(yàn)結(jié)果50-51
• 4.3.1 各試劑最佳工作濃度測(cè)試結(jié)果50
• 4.3.2 檢測(cè)結(jié)果分析50-51
• 4.4 討論51-52
• 第五章 全文結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 附錄58-59
• 致謝59-60
• 作者簡(jiǎn)歷60

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