【摘要】：下丘腦神經(jīng)肽促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)及親吻肽(kisspeptin,Kiss)在哺乳類生殖調(diào)控中起著直接而相反的作用。為了研究二者對(duì)魚類生殖軸的調(diào)控作用,本文以半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)為研究對(duì)象,首先運(yùn)用RT-PCR及RACE方法克隆獲得了gnih及其受體gnihr、親吻肽受體kiss2r的全長(zhǎng)cDNA序列,并鑒定出了部分kiss2序列。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)gnih編碼兩種多肽Gn IH-1及GnIH-2,而kiss2編碼一種核心十肽Kiss2-10。隨后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了gnih/gnihr及kiss2/kiss2r的組織分布以及gnih在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)特性。最后,通過(guò)離體孵育實(shí)驗(yàn),結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR及ELISA方法分別研究了GnIH和Kiss多肽對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)與垂體激素合成及分泌的影響。主要研究結(jié)果如下:1.Gn IH/GnIHR系統(tǒng)鑒定1.1半滑舌鰨gnih/gnihr基因克隆和組織表達(dá)分析采用RT-PCR及RACE方法首次從半滑舌鰨腦中克隆得到了gnih/gnihr的全長(zhǎng)cDNA序列。半滑舌鰨gnih cDNA全長(zhǎng)為918 bp,其中5’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)為24 bp,3’UTR為309 bp,開放閱讀框(open reading frame,ORF)為585bp,編碼194個(gè)氨基酸的前體多肽。Gn IH前體蛋白分子質(zhì)量為21.73 kDa,等電點(diǎn)為6.52。Gn IH前體多肽編碼GnIH-1和GnIH-2兩種多肽。gnihr cDNA全長(zhǎng)為2201 bp,其中5’UTR為60 bp,3’UTR為776 bp,ORF為1365 bp,編碼454個(gè)氨基酸。Gn IHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體,包括七個(gè)跨膜區(qū),七個(gè)磷酸化位點(diǎn)及五個(gè)糖基化位點(diǎn)。組織分布結(jié)果顯示gnih主要在腦中表達(dá),在卵巢、心臟、胃中的表達(dá)量相對(duì)稍低;在垂體及其他外周組織中表達(dá)量極低;gnihr主要分布于腦、垂體中,其次為卵巢、心臟,但在其他外周組織中表達(dá)量較低。1.2半滑舌鰨gnih在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)特性在卵巢成熟過(guò)程中,腦gnih mRNA表達(dá)量在卵黃生成期(III期)略微增加,在成熟期(V期)顯著性下降,然而在排卵后期(VI期)又顯著性增加并達(dá)到峰值;垂體gnih mRNA表達(dá)量除在成熟期(V期)顯著性增加并達(dá)到峰值外,在卵巢成熟的其他時(shí)期保持穩(wěn)定;卵巢gnih mRNA表達(dá)量在卵黃生成期(III期)急劇下降,并在整個(gè)卵巢成熟過(guò)程中保持較低的表達(dá)水平。1.3 Gn IH對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響本研究首次通過(guò)下丘腦離體孵育的方法分析了GnIH多肽對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。研究結(jié)果顯示,GnIH-1促進(jìn)了gnrh2和gnih的表達(dá),但是對(duì)gnrh3和kiss2的表達(dá)無(wú)顯著影響;然而GnIH-2抑制了gnrh3的表達(dá),對(duì)gnrh2、kiss2和gnih的表達(dá)無(wú)顯著影響。1.4 Gn IH對(duì)半滑舌鰨垂體激素合成及分泌的影響本研究首次通過(guò)垂體離體孵育的方法分析了Gn IH多肽對(duì)半滑舌鰨垂體促性腺激素(gonadotropin,GTH)及生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)合成及分泌的影響。結(jié)果表明,Gn IH-1促進(jìn)了gh mRNA的表達(dá),對(duì)lhβ、fshβ、gthαmRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響;Gn IH-2則對(duì)這些基因的表達(dá)均無(wú)顯著影響。此外,Gn IH-1與GnIH-2均抑制了LH分泌,但對(duì)GH及FSH分泌無(wú)顯著影響。2 Kiss/KissR系統(tǒng)2.1半滑舌鰨kiss2/kiss2r基因克隆和組織表達(dá)分析本研究克隆得到了kiss2的部分cDNA序列,該序列長(zhǎng)度為274 bp,編碼90個(gè)氨基酸的前體蛋白。該前體多肽包括功能核心十肽Kiss2-10(FNFNPFGLRF)。半滑舌鰨kiss2r全長(zhǎng)cDNA序列為1966 bp,其中5’UTR為342 bp,3’UTR為481bp,ORF為1143 bp,編碼380個(gè)氨基酸。Kiss2R也屬于G蛋白偶聯(lián)受體,包括七個(gè)跨膜區(qū),八個(gè)磷酸化位點(diǎn)及三個(gè)糖基化位點(diǎn)。組織分布結(jié)果表明kiss2 mRNA主要在卵巢中表達(dá),在腦與垂體中表達(dá)量相對(duì)較高,但其他外周組織中表達(dá)量較低。然而kiss2r則主要在腦中表達(dá),在垂體及其他外周組織中表達(dá)水平較低。2.2 Kiss2對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響本研究首次通過(guò)下丘腦離體孵育的方法研究了Kiss2對(duì)半滑舌鰨下丘腦生殖相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的影響。結(jié)果表明,Kiss2對(duì)gnrh2和gnrh3表達(dá)無(wú)顯著影響;Kiss2促進(jìn)了gnih的表達(dá),卻抑制了gnihr的表達(dá);此外,Kiss2促進(jìn)了自身配體kiss2的表達(dá),卻抑制了自身受體kiss2r的表達(dá)。2.3 Kiss2對(duì)半滑舌鰨垂體激素合成及分泌的影響本研究首次通過(guò)垂體離體孵育的方法研究了Kiss2對(duì)半滑舌鰨垂體GTH和GH合成及分泌的影響。研究結(jié)果表明,Kiss2對(duì)gthα、lhβ、fshβ和gh表達(dá)無(wú)顯著影響;此外,Kiss2也對(duì)垂體GH分泌無(wú)顯著影響,卻顯著性抑制了LH和FSH分泌。
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【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 王濱;柳學(xué)周;劉權(quán);趙明;徐永江;史寶;;半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)gnrh2基因克隆、組織分布及卵巢成熟過(guò)程中表達(dá)分析[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2017年01期

2 李文笙;王濱;;魚類生長(zhǎng)抑素調(diào)控垂體生長(zhǎng)激素分泌的作用機(jī)制[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2013年12期

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4 柳學(xué)周;徐永江;劉乃真;曲建忠;倪娜;趙明;;半滑舌鰨卵巢發(fā)育的組織學(xué)和形態(tài)數(shù)量特征研究[J];漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展;2009年06期

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本文編號(hào)：2419084