【摘要】：下丘腦神經(jīng)肽促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)及親吻肽(kisspeptin,Kiss)在哺乳類生殖調(diào)控中起著直接而相反的作用。為了研究二者對魚類生殖軸的調(diào)控作用,本文以半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)為研究對象,首先運用RT-PCR及RACE方法克隆獲得了gnih及其受體gnihr、親吻肽受體kiss2r的全長cDNA序列,并鑒定出了部分kiss2序列。進一步分析發(fā)現(xiàn)gnih編碼兩種多肽Gn IH-1及GnIH-2,而kiss2編碼一種核心十肽Kiss2-10。隨后,采用實時熒光定量PCR技術檢測了gnih/gnihr及kiss2/kiss2r的組織分布以及gnih在卵巢不同發(fā)育時期的時空表達特性。最后,通過離體孵育實驗,結合實時熒光定量PCR及ELISA方法分別研究了GnIH和Kiss多肽對半滑舌鰨下丘腦生殖相關基因表達與垂體激素合成及分泌的影響。主要研究結果如下:1.Gn IH/GnIHR系統(tǒng)鑒定1.1半滑舌鰨gnih/gnihr基因克隆和組織表達分析采用RT-PCR及RACE方法首次從半滑舌鰨腦中克隆得到了gnih/gnihr的全長cDNA序列。半滑舌鰨gnih cDNA全長為918 bp,其中5’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)為24 bp,3’UTR為309 bp,開放閱讀框(open reading frame,ORF)為585bp,編碼194個氨基酸的前體多肽。Gn IH前體蛋白分子質(zhì)量為21.73 kDa,等電點為6.52。Gn IH前體多肽編碼GnIH-1和GnIH-2兩種多肽。gnihr cDNA全長為2201 bp,其中5’UTR為60 bp,3’UTR為776 bp,ORF為1365 bp,編碼454個氨基酸。Gn IHR屬于G蛋白偶聯(lián)受體,包括七個跨膜區(qū),七個磷酸化位點及五個糖基化位點。組織分布結果顯示gnih主要在腦中表達,在卵巢、心臟、胃中的表達量相對稍低;在垂體及其他外周組織中表達量極低;gnihr主要分布于腦、垂體中,其次為卵巢、心臟,但在其他外周組織中表達量較低。1.2半滑舌鰨gnih在卵巢不同發(fā)育時期的時空表達特性在卵巢成熟過程中,腦gnih mRNA表達量在卵黃生成期(III期)略微增加,在成熟期(V期)顯著性下降,然而在排卵后期(VI期)又顯著性增加并達到峰值;垂體gnih mRNA表達量除在成熟期(V期)顯著性增加并達到峰值外,在卵巢成熟的其他時期保持穩(wěn)定;卵巢gnih mRNA表達量在卵黃生成期(III期)急劇下降,并在整個卵巢成熟過程中保持較低的表達水平。1.3 Gn IH對半滑舌鰨下丘腦生殖相關基因表達調(diào)控的影響本研究首次通過下丘腦離體孵育的方法分析了GnIH多肽對半滑舌鰨下丘腦生殖相關基因表達調(diào)控的影響。研究結果顯示,GnIH-1促進了gnrh2和gnih的表達,但是對gnrh3和kiss2的表達無顯著影響;然而GnIH-2抑制了gnrh3的表達,對gnrh2、kiss2和gnih的表達無顯著影響。1.4 Gn IH對半滑舌鰨垂體激素合成及分泌的影響本研究首次通過垂體離體孵育的方法分析了Gn IH多肽對半滑舌鰨垂體促性腺激素(gonadotropin,GTH)及生長激素(growth hormone,GH)合成及分泌的影響。結果表明,Gn IH-1促進了gh mRNA的表達,對lhβ、fshβ、gthαmRNA的表達無顯著影響;Gn IH-2則對這些基因的表達均無顯著影響。此外,Gn IH-1與GnIH-2均抑制了LH分泌,但對GH及FSH分泌無顯著影響。2 Kiss/KissR系統(tǒng)2.1半滑舌鰨kiss2/kiss2r基因克隆和組織表達分析本研究克隆得到了kiss2的部分cDNA序列,該序列長度為274 bp,編碼90個氨基酸的前體蛋白。該前體多肽包括功能核心十肽Kiss2-10(FNFNPFGLRF)。半滑舌鰨kiss2r全長cDNA序列為1966 bp,其中5’UTR為342 bp,3’UTR為481bp,ORF為1143 bp,編碼380個氨基酸。Kiss2R也屬于G蛋白偶聯(lián)受體,包括七個跨膜區(qū),八個磷酸化位點及三個糖基化位點。組織分布結果表明kiss2 mRNA主要在卵巢中表達,在腦與垂體中表達量相對較高,但其他外周組織中表達量較低。然而kiss2r則主要在腦中表達,在垂體及其他外周組織中表達水平較低。2.2 Kiss2對半滑舌鰨下丘腦生殖相關基因表達調(diào)控的影響本研究首次通過下丘腦離體孵育的方法研究了Kiss2對半滑舌鰨下丘腦生殖相關基因表達調(diào)控的影響。結果表明,Kiss2對gnrh2和gnrh3表達無顯著影響;Kiss2促進了gnih的表達,卻抑制了gnihr的表達;此外,Kiss2促進了自身配體kiss2的表達,卻抑制了自身受體kiss2r的表達。2.3 Kiss2對半滑舌鰨垂體激素合成及分泌的影響本研究首次通過垂體離體孵育的方法研究了Kiss2對半滑舌鰨垂體GTH和GH合成及分泌的影響。研究結果表明,Kiss2對gthα、lhβ、fshβ和gh表達無顯著影響;此外,Kiss2也對垂體GH分泌無顯著影響,卻顯著性抑制了LH和FSH分泌。
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【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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1 王濱;柳學周;劉權;趙明;徐永江;史寶;;半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)gnrh2基因克隆、組織分布及卵巢成熟過程中表達分析[J];漁業(yè)科學進展;2017年01期

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本文編號：2419084