【摘要】：橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsaliss(Hendel)是一種危害廣泛的果蔬害蟲,每年在我國乃至全球都造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。磷脂酶A2(PLA2)作為一類可以在sn-2位水解細(xì)胞膜磷脂的酶,其水解產(chǎn)物包含多種游離脂肪酸和溶血磷脂。PLA2酶可參與脂類消化代謝、細(xì)胞膜重塑、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)生理過程。近年來PLA2也被報(bào)道在免疫和生殖兩大系統(tǒng)發(fā)揮重要作用,然而在昆蟲中,PLA2是否參與到體液免疫和生殖中目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要采用RNAi的方法沉默橘小實(shí)蠅體內(nèi)PLA2基因,分析橘小實(shí)蠅體液免疫反應(yīng)及生殖能力的變化,闡述PLA2的作用機(jī)制,以期為橘小實(shí)蠅的科學(xué)綜合防治提供新的思路和新的作用標(biāo)靶。1.橘小實(shí)蠅PLA2基因表達(dá)模式根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的橘小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組文庫,我們獲得了在橘小實(shí)蠅成蟲階段高表達(dá)的PLA2基因全長,編碼區(qū)與其它昆蟲PLA2的序列同源性均較高。不同齡期的相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果表明:PLA2在橘小實(shí)蠅卵期和成蟲期表達(dá)顯著高于其他齡期。成蟲不同組織中的表達(dá)量結(jié)果則顯示:PLA2在成蟲脂肪體和精巢中的表達(dá)量高于其他組織。2.PLA2調(diào)節(jié)橘小實(shí)蠅體液免疫反應(yīng)三種不同的病原菌單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)刺激橘小實(shí)蠅后,結(jié)果顯示,病原菌刺激均可以增高橘小實(shí)蠅體內(nèi)PLA2的表達(dá)量,且均在脂肪體中增高幅度最大。沉默PLA2基因顯著降低體液免疫通路基因的表達(dá)量,包括Toll通路中的My D88和defensin以及Imd通路中的relish和diptericin基因的表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著的下調(diào)。橘小實(shí)蠅干擾處理后再進(jìn)行病原菌刺激,結(jié)果顯示;注射L.monocytogenes和S.aureus后,ds-egfp組My D88和defensin表達(dá)量顯著高于CK組,而ds-PLA2組中My D88表達(dá)量比ds-egfp組中分別減少了47%和57%,defensin表達(dá)量相對(duì)于ds-egfp組則下調(diào)了66%和58%。感染L.monocytogenes和E.coli后24小時(shí),我們檢測(cè)了Imd通路中relish和diptericin基因表達(dá)水平,在ds-egfp組中兩個(gè)檢測(cè)基因的表達(dá)水平都顯著高于CK組。而相較于ds-egfp組,ds-PLA2組中relish和diptericin基因的表達(dá)水平均出現(xiàn)了下調(diào)。注射L.monocytogenes后,ds-PLA2組中relish和diptericin比ds-egfp組分別發(fā)生了60%和44%的下調(diào)。而注射E.coli后,ds-PLA2組中relish和diptericin比ds-egfp組分別發(fā)生了71%和54%的下調(diào)。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)注射L.monocytogenes后,ds-PLA2組橘小實(shí)蠅MTD減少,死亡率增多。這些結(jié)果表明,PLA2基因參與調(diào)節(jié)橘小實(shí)蠅體液免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步探究PLA2在橘小實(shí)蠅體液免疫反應(yīng)中作用機(jī)制,我們用尼羅紅染色法觀察檢測(cè)了橘小實(shí)蠅脂肪體細(xì)胞的形態(tài)。PLA2基因沉默后,脂肪體細(xì)胞中油脂滴顯著減少,脂肪體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。這表明,PLA2可能通過影響脂肪體細(xì)胞中脂類的含量來調(diào)節(jié)昆蟲體液免疫反應(yīng)。3.PLA2影響橘小實(shí)蠅雄蟲生殖能力我們檢測(cè)了橘小實(shí)蠅雄蟲羽化后體內(nèi)PLA2的表達(dá)譜,結(jié)果顯示,PLA2表達(dá)量在雄蟲性成熟前有一個(gè)急速增高期。同時(shí),我們采用了兩次注射法RNAi成功地在橘小實(shí)蠅雄蟲交配前始終抑制PLA2的表達(dá)量。處理過的雄蟲與正常處女雌蟲交配后,其子代卵的孵化率、單雌子代幼蟲數(shù)、卵到蛹的存活率顯著降低。為探究其作用機(jī)理,我們對(duì)雄蟲精子進(jìn)行了熒光染色,測(cè)定精子活力。結(jié)果顯示,PLA2沉默后雄蟲體內(nèi)精子總數(shù)沒有顯著變化,但精子存活率顯著降低。對(duì)照組中活精子占總精子數(shù)的70.1%,而沉默PLA2后活精子僅占41.5%,下降了40.8%。這表明PLA2可通過調(diào)節(jié)橘小實(shí)蠅雄蟲精子的存活率來影響雄蟲的生殖能力。以上結(jié)果表明,PLA2可調(diào)節(jié)橘小實(shí)蠅脂肪體細(xì)胞內(nèi)脂類含量和雄蟲精子的存活率,從而調(diào)節(jié)體液免疫和雄蟲的生殖能力,在橘小實(shí)蠅免疫和生殖中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2370048