【摘要】：桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel),隸屬雙翅目Diptera,實(shí)蠅科Tephritidae,是一類世界性的農(nóng)業(yè)害蟲,分布范圍廣,危害多種水果蔬菜。由于長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑防治,導(dǎo)致桔小實(shí)蠅的抗藥性迅速發(fā)展,使傳統(tǒng)的殺蟲劑難以達(dá)到高效防控的目的。因此,尋找新的藥劑靶標(biāo),開發(fā)新型藥劑成為目前研究的重點(diǎn)。章魚胺octopamine(OA)作為昆蟲體內(nèi)一種重要的生物胺,在昆蟲體內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種重要的生理活動(dòng),偶聯(lián)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),與細(xì)胞內(nèi)外第二信使的傳遞關(guān)系密切。章魚胺主要通過與其受體結(jié)合,發(fā)揮各種功能。已有研究表明,章魚胺受體作為一類典型的G蛋白偶聯(lián)受體,是許多殺蟲劑的潛在作用靶標(biāo)。鑒于此,本學(xué)位論文研究根據(jù)桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組篩選得到的4個(gè)章魚胺受體基因,選取在其他昆蟲中研究較為深入同時(shí)功能較為重要的2個(gè)β-adrenergic-like章魚胺受體基因BdOctβ1R和BdOctβ2R,通過分析其分子生物學(xué)特性、藥理學(xué)性質(zhì)以及生理功能,評(píng)估作為新型藥劑靶標(biāo)的潛力,為桔小實(shí)蠅新型控制劑的開發(fā)提供新思路。主要研究結(jié)果如下:1.桔小實(shí)蠅BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的cDNA克隆及序列分析通過分析和篩選桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)合RT-PCR克隆技術(shù),成功獲得了桔小實(shí)蠅章魚胺受體基因BdOctβ1R和Bd Octβ2R的cDNA全長(zhǎng)序列。利用TMHMM軟件,預(yù)測(cè)推導(dǎo)的2個(gè)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因編碼的蛋白序列都具有7跨膜結(jié)構(gòu),屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體。與已報(bào)道的模式昆蟲果蠅、赤擬谷盜以及家蠶的β-adrenergic-like受體進(jìn)行多序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因序列具有相似的保守區(qū)域,同時(shí)表現(xiàn)出較高的同源性;通過與其他昆蟲的章魚胺受體的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果顯示BdOctβ1R和BdOctβ2R與其他昆蟲的β-adrenergic-like受體聚在一起,同源性較高,親緣關(guān)系較近,因此,BdOctβ1R和BdOctβ2R屬于β-adrenergic-like章魚胺受體。2.桔小實(shí)蠅BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的表達(dá)模式解析利用RT-qPCR技術(shù),解析桔小實(shí)蠅BdOctβ1R和BdOctβ2R在不同發(fā)育階段和不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小實(shí)蠅的各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá),其中在幼蟲和成蟲階段具有較高的表達(dá)水平,從蛹期到成蟲階段,其表達(dá)量均為先降低后升高,并且分別在成蟲的3日齡和7日齡達(dá)到最高。同時(shí),檢測(cè)這2個(gè)基因在桔小實(shí)蠅不同組織中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)BdOctβ1R和BdOctβ2R均在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)顯著高表達(dá),表明octopamine與中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的BdOctβ1R和BdOctβ2R結(jié)合而發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)的作用。饑餓脅迫能夠顯著誘導(dǎo)BdOctβ1R和BdOctβ2R的表達(dá)上調(diào),尤其是BdOctβ1R的表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào),暗示BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小實(shí)蠅應(yīng)對(duì)饑餓條件的生理活動(dòng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用。而在極端溫度脅迫下,BdOctβ1R和BdOctβ2R的表達(dá)水平并未表現(xiàn)出明顯的變化。3.桔小實(shí)蠅BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的生理功能分析基于BdOctβ1R和BdOctβ2R在饑餓和不同溫度處理后的表達(dá)模式,進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)探究Bd Octβ1R和BdOctβ2R在桔小實(shí)蠅應(yīng)對(duì)饑餓脅迫以及繁殖等生命活動(dòng)中的重要功能。結(jié)果表明,在對(duì)BdOctβ1R的沉默效率達(dá)到70%的情況下,RNAi后的桔小實(shí)蠅在饑餓處理中死亡率較對(duì)照雖有所升高,但并無顯著差異,說明BdOctβ1R雖然參與調(diào)節(jié)桔小實(shí)蠅應(yīng)對(duì)饑餓脅迫,但其并未直接起到調(diào)節(jié)作用。而對(duì)BdOctβ2R的RNAi效果不明顯,注射dsRNA后基因沉默效率僅為27%,也未對(duì)桔小實(shí)蠅交配率和產(chǎn)卵量造成顯著影響。4.桔小實(shí)蠅BdOctβ1R和Bd Octβ2R基因的真核表達(dá)及其藥理學(xué)特性分析以pcDNA3.1質(zhì)粒為重組載體,章魚胺受體的模式配體octopamine能夠有效地激活BdOctβ1R和BdOctβ2R,并且其激活能力呈濃度依賴性,EC50值分別是9.11×10 10和1.29×10 9 M,說明BdOctβ1R和BdOctβ2R均在HEK細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了功能性表達(dá)。進(jìn)一步測(cè)定5種激動(dòng)劑(octopamine、tyramine、naphazoline、dopamine和phentolamine)和3種拮抗劑(mianserin、phentolamine和chlorpromazine)對(duì)BdOctβ1R和Bd Octβ2R的活力。激動(dòng)劑活性測(cè)定中,naphazoline是BdOctβ1R和BdOctβ2R特異性最強(qiáng)、效果最好的激動(dòng)劑,tyramine展現(xiàn)了一定的激動(dòng)效應(yīng),而dopamine對(duì)BdOctβ1R和BdOctβ2R的激動(dòng)效應(yīng)極弱。拮抗劑活性測(cè)定中,phentolamine對(duì)BdOctβ2R的拮抗效應(yīng)強(qiáng)于BdOctβ1R,chlorpromazine對(duì)于兩者的作用效果均較小。mianserin對(duì)于2個(gè)基因所表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)的cAMP反應(yīng)都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,有明顯的拮抗效應(yīng)。綜上所述,本研究在分析桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,利用分子克隆技術(shù)獲得了BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的cDNA序列,為深入研究基因的功能提供了分子基礎(chǔ);利用生物信息學(xué)方法分析2個(gè)基因的序列結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,豐富了BdOctβ1R和BdOctβ2R基因的遺傳信息;進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)全面解析了BdOctβ1R和BdOctβ2R在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段、組織特異性表達(dá)模式及其在不同脅迫條件下轉(zhuǎn)錄水平的變化,為揭示其生理功能奠定基礎(chǔ);隨后利用RNAi技術(shù),初步明確了這2個(gè)章魚胺受體基因在桔小實(shí)蠅體內(nèi)所承擔(dān)的重要生理功能;最后利用體外HEK細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng),成功表達(dá)了BdOctβ1R和BdOctβ2R,構(gòu)建了桔小實(shí)蠅章魚胺受體功能測(cè)定的平臺(tái),并分析了其藥理學(xué)特性。研究結(jié)果將促進(jìn)對(duì)桔小實(shí)蠅章魚胺受體生理功能的認(rèn)識(shí),為構(gòu)建桔小實(shí)蠅章魚胺激動(dòng)劑和拮抗劑篩選技術(shù)體系奠定基礎(chǔ),對(duì)開發(fā)以章魚胺受體為靶標(biāo)的新型殺蟲劑具有重要的科學(xué)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2181964