本文選題：中華絨螯蟹 + DDB1　； 參考：《華東師范大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir Sinensis)又稱河蟹,隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目,因具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值而成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖主要品種之一。DNA損傷結(jié)合蛋白(DDB1)是一個多功能的蛋白,參與核酸剪切修復(fù)通路NER,通過識別紫外引起的DNA損傷從而激活核酸剪切修復(fù)進程,并且在泛素化過程中作為Culin4A的連接蛋白形成E3泛素連接酶調(diào)控細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)以及損傷修復(fù)等很多重要過程。近年來有研究發(fā)現(xiàn)DDB1參與胚胎發(fā)育和精子發(fā)生過程,然而甲殼類動物中DDB1的研究還較少。為了探究中華絨螯蟹DDB1是否參與調(diào)控生殖過程,本研究從中華絨螯蟹中克隆獲得DDB1基因(Es-DDB1)cDNA全長,序列分析顯示該基因由4871個核酸組成,ORF區(qū)為3414bp,編碼1137個氨基酸,蛋白分子量為125KDa。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Es-DDB1包含一個MMS1_N和一個CPSF_A功能域,晶體結(jié)構(gòu)包含三個BP結(jié)構(gòu)域(BPA,BPB,BPC)和一個CTD結(jié)構(gòu)域,通過對比發(fā)現(xiàn)Es-DDB1在進化中的功能域和結(jié)構(gòu)都是高度保守的。實時定量PCR和蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)Es-DDB1在中華絨螯蟹各組織均有表達,且無論是mRNA還是蛋白豐度都在精巢中較高,暗示Es-DDB1參與該蟹精巢發(fā)育過程。檢測精子發(fā)生過程中Es-DDB1的表達量發(fā)現(xiàn),Es-DDB1在精子發(fā)生的前期表達量最高,并隨著發(fā)育的進行逐漸降低,暗示Es-DDB1可能參與調(diào)控了早期精子發(fā)生過程。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Es-DDB1和Es-cu14在中華絨螯蟹中是以復(fù)合體的形式共同作用的。通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)Es-DDB1主要分布在精原細(xì)胞期和精母細(xì)胞期的細(xì)胞質(zhì)中,顯示出非常強烈的陽性信號,這與實時定量PCR和蛋白免疫印跡實驗結(jié)果一致,但隨著發(fā)育的進行,Es-DDB1的陽性信號逐漸減弱直至精細(xì)胞期變得非常微弱,且發(fā)生了位置的轉(zhuǎn)移,開始從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。以上實驗結(jié)果表明中華絨螯蟹Es-DDB1參與調(diào)控生殖過程,與Es-Cul4結(jié)合成復(fù)合體的形式參與包括精子發(fā)生在內(nèi)的重要的細(xì)胞過程。
[Abstract]:Eriocheir sinensis, also known as Eriocheir sinensis, belongs to Arthropoda, crustacea, Decapoda. Because of its high nutritional and economic value, Eriocheir sinensis has become one of the main aquaculture species in China. DNA damage binding protein (DDB1) is a multifunctional protein. Participate in the nucleic acid cleavage repair pathway ner, by recognizing the ultraviolet induced DNA damage, activate the nucleic acid shearing repair process, and in the course of Ubiquidization, form the E3 ubiquitin ligase to regulate cell cycle and gene transcription. Signal transduction and damage repair are many important processes. In recent years, it has been found that DDB1 is involved in embryonic development and spermatogenesis. However, there are few studies on DDB1 in crustaceans. In order to investigate whether DDB1 participates in the regulation of reproduction, the full-length cDNA of DDB1 gene (Es-DDB1) was cloned from Eriocheir sinensis. Sequence analysis showed that DDB1 gene was composed of 4871 nucleic acids in the ORF region of 3414 BP, encoding 1137 amino acids and the molecular weight of protein was 125 KDa. Bioinformatics analysis showed that Es-DDB1 contained a MMS1N and a CPSFA functional domain, and the crystal structure consisted of three BP domains (BPA-BPBPP-BPC) and a CTD domain. The functional domain and structure of Es-DDB1 were highly conserved in evolution. Real-time quantitative PCR and Western blot analysis showed that Es-DDB1 was expressed in all tissues of Eriocheir sinensis, and both mRNA and protein abundance were higher in spermary, suggesting that Es-DDB1 was involved in the development of spermary of Eriocheir sinensis. Detection of Es-DDB1 expression during spermatogenesis showed that Es-DDB1 expression was the highest in the early stage of spermatogenesis and decreased with the development of spermatogenesis, suggesting that Es-DDB1 may be involved in the regulation of early spermatogenesis. Immunoprecipitation assay showed that Es-DDB1 and Es-cu14 acted in the form of complex in Eriocheir sinensis (Eriocheir sinensis). Immunofluorescence assay showed that Es-DDB1 was mainly distributed in the cytoplasm of spermatogonia and spermatocytes, and showed very strong positive signals, which was consistent with the results of real-time quantitative PCR and Western blot. However, the positive signal of Es-DDB1 decreased gradually with the development until the spermatocyte phase became very weak, and the location of the transfer occurred, and began to transfer from the cytoplasm to the nucleus. These results suggest that Es-DDB1 is involved in the regulation of reproductive process, and the combination of Es-Cul4 and Es-Cul4 is involved in important cellular processes, including spermatogenesis.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：2086076