本文選題：豬流行性腹瀉病毒 + nsp7��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬腹瀉給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,該病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬,基因組為單股正鏈RNA,大小約28kb,共編碼16個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1~nsp16),4個結(jié)構(gòu)蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)及一個輔助蛋白ORF3。在病毒的感染過程中,宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種抵抗病毒入侵的分子,包括干擾素(Interferon,IFN),促炎性細(xì)胞因子以及趨化因子等。干擾素及其誘導(dǎo)的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)是宿主抗病毒感染的重要防御機制,但病毒往往進化出各種策略拮抗宿主干擾素的抗病毒作用,從而達到感染宿主并致病的目的。已有研究證實PEDV具有抑制Ⅰ型IFN產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力,但對其編碼的nsp7蛋白在其中的作用尚不清楚。鑒于此,本論文以PEDV nsp7為研究對象,開展了以下研究:1.PEDV nsp7抑制ISRE啟動子活化和ISGs的產(chǎn)生PEDV可以感染不同年齡段的豬,因此其免疫逃逸策略的研究十分值得我們關(guān)注。而許多病毒拮抗IFN的免疫應(yīng)答多是憑借其編碼產(chǎn)生的蛋白實現(xiàn)的。因此,本研究篩選了參與抑制ISRE啟動子活化的PEDV編碼蛋白,結(jié)果顯示,nsp7能夠顯著抑制IFN-α介導(dǎo)的ISRE啟動子活化,且其抑制效果呈明顯的劑量依賴性。同時,熒光定量PCR實驗證實PEDV nsp7能夠顯著抑制ISG15、ISG54及ISG56在mRNA水平上的表達。2.PEDV nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2磷酸化和ISGF3的形成許多病毒在進化過程中形成多種策略來擾亂Ⅰ型IFN的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Western blot實驗顯示,PEDV nsp7不影響JAK1、Tyk2、STAT1和STAT2的蛋白表達以及磷酸化水平,同時對STAT1/STAT2/IRF9三者組成的復(fù)合物ISGF3的形成也沒有影響,但是可以顯著抑制ISGF3復(fù)合物誘導(dǎo)的ISRE啟動子活化,并且與ISGF3間存在相互作用。ISGF3的入核是ISGs產(chǎn)生的必須環(huán)節(jié)。PEDV nsp7不影響STAT1、STAT2的表達與磷酸化及ISGF3復(fù)合物的形成,但卻抑制ISGF3誘導(dǎo)的ISRE啟動子活性,那么它是否會影響STAT1、STAT2的入核呢?我們分別進行間接免疫熒光實驗和胞質(zhì)胞核分離實驗進行檢測,結(jié)果顯示,PEDV nsp7能夠顯著抑制STAT1、STAT2、IRF9的核轉(zhuǎn)運。3.PEDV nsp7與KPNA1競爭性結(jié)合STAT1,阻礙ISGF3核轉(zhuǎn)運由于PEDV nsp7明顯地抑制STAT1、STAT2、IRF9的入核,且PEDV nsp7與ISGF3復(fù)合物存在相互作用,推測PEDV nsp7的抑制效果可能是通過與STAT1、STAT2或IRF9相互作用實現(xiàn)的。通過免疫共沉淀實驗我們得出結(jié)論,PEDV nsp7與IRF9間不存在相互作用,但可與STAT1、STAT2發(fā)生互作,且特異性結(jié)合STAT2的DBD結(jié)構(gòu)域,此結(jié)構(gòu)域在STATs蛋白家族中同源性較高,存在非典型的NLS序列,是ISGF3復(fù)合物被核轉(zhuǎn)運蛋白KPNA1識別的關(guān)鍵氨基酸序列。鑒于此,我們利用CO-IP實驗檢測nsp7是否影響KPNA1與STAT1的結(jié)合。結(jié)果表明,隨著nsp7轉(zhuǎn)染量的增加,KPNA1與STAT1間的互作逐步減弱,因此,PEDV nsp7通過與KPNA1競爭性結(jié)合STAT1,抑制KPNA1對STAT1的識別,從而特異性阻礙了ISGF3核轉(zhuǎn)運。4.PEDV nsp7負(fù)調(diào)控Ⅰ型IFN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與nsp8無關(guān)已有研究表明,貓冠狀病毒nsp7/nsp8復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)2:1的異源三聚體形式,與nsp7的結(jié)合可增強nsp8的RNA聚合酶活性;SARS冠狀病毒中nsp7/nsp8以8:8的形式組成十六聚體,能夠顯著增強nsp8具有的RdRp活性且具有引物延伸能力。那么,nsp7對JAK-STAT信號通路的抑制作用是否與nsp8相關(guān)呢?我們將nsp7、nsp8單獨轉(zhuǎn)染或者以不同比例共轉(zhuǎn)染于HEK-293T細(xì)胞,收樣后利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行分析,結(jié)果顯示nsp8本身不誘導(dǎo)ISRE啟動子活化,且nsp7對ISRE啟動子活性的抑制作用不依賴于nsp8。
[Abstract]:The results showed that PEDV nsp7 inhibited the activation and phosphorylation of ISG15 , ISG54 and STAT2 . The results showed that PEDV nsp7 inhibited the activation of ISG15 , ISG54 and STAT2 . In this paper , we concluded that PEDV nsp7 had no interaction with STAT1 , STAT2 or IRF9 . The results showed that there was no interaction with STAT1 , STAT2 or IRF9 .

【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高慎陽;劉延慶;李一經(jīng);;豬流行性腹瀉病毒(PEDV)M蛋白原核表達載體的構(gòu)建[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2009年12期

2 古洪浪;鄧勝朝;崔進;劉曉露;劉超;袁航;馬嵐;張桂紅;;豬流行性腹瀉病毒PEDV-GD12株的分離與鑒定[J];中國獸醫(yī)雜志;2013年11期

3 杜曉莉;王一成;吳潤;徐麗華;袁秀芳;李軍星;周曉麗;;2010—2013年浙江省豬流行性腹瀉病毒臨床檢測及PEDV-S基因型分析[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2014年03期

4 鄧祖麗穎;陳陸;;豬流行性腹瀉病毒巢式RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年01期

5 李寶賢;馬廣鵬;葛俊偉;李一經(jīng);;豬流行性腹瀉病毒功能性受體的鑒定[J];病毒學(xué)報;2009年03期

6 ;Cloning the Structure Genes and Expression the N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus DX[J];Virologica Sinica;2009年03期

7 田克恭;;兔胸水滲出病[J];上海實驗動物科學(xué);1993年02期

8 喬憲鳳,熊忠良,華文君,鄭新民;PEDV膜蛋白基因RT-PCR最適反應(yīng)條件的確立[J];湖北畜牧獸醫(yī);2001年01期

9 高慎陽;王s，

本文編號：1778850