發(fā)布時(shí)間：2018-04-10 01:30

  本文選題：弓形蟲　切入點(diǎn)：間接ELISA　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：弓形蟲是一種全球性分布的人畜共患寄生蟲,全世界每年約有190,100人感染弓形蟲病。該病的宿主較為廣泛,可感染所有溫血?jiǎng)游锛安糠肿儨貏?dòng)物。健康人群呈隱性感染,一般不出現(xiàn)癥狀,但艾滋病人及一些患有免疫缺陷類疾病的患者癥狀較明顯。貓既是弓形蟲的終末宿主又是中間宿主。人類主要通過攝入被污染的或未煮熟的含有包囊的食物感染。處于妊娠期的人類及動(dòng)物感染后常表現(xiàn)為妊娠終止,出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱子等癥狀。目前弓形蟲的診斷方法主要包括:病原學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷等。弓形蟲表面抗原(SAG)基因家族成員較多。主要包括SAG1、SAG2、SAG3三種。SAG3存在于弓形蟲侵入宿主細(xì)胞的所有階段,大小在43KDa。家族成員中與SAG3最為相似的是SAG1。SAG1是速殖子的特異性抗原,其免疫原性較好,廣泛的應(yīng)用于核酸疫苗的研究,被認(rèn)為是弓形蟲疫苗制備的首選。SAG3和SAG1具有相同結(jié)構(gòu)和功能,目前對(duì)于SAG1的報(bào)道有很多,但是關(guān)于SAG3的報(bào)道較少,因此,本研究選擇SAG3進(jìn)行貓弓形蟲感染檢測(cè)方法的建立。貓弓形蟲感染間接ELISA檢測(cè)方法的建立本研究選用純化后的弓形蟲表面抗原SAG3作為包被抗原,優(yōu)化條件后進(jìn)行ELISA檢測(cè)方法的建立。最后確定抗原的最佳包被量為0.75μg/孔;待檢血清的最佳稀釋比例為1:800;HRP標(biāo)記山羊抗貓Ig G最適稀釋比例為1:5000;敏感度可達(dá)到1:12800;選取貓杯狀病毒標(biāo)準(zhǔn)血清和貓傳染性胃腸炎病毒標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行特異性試驗(yàn),結(jié)果未有交叉反應(yīng)出現(xiàn),本試驗(yàn)方法特異性較好;選取不同生產(chǎn)日期的96孔檢測(cè)板進(jìn)行批間和批內(nèi)試驗(yàn),結(jié)果顯示:批間試驗(yàn)和批內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于6%。對(duì)臨床中96份貓血清樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果與商品化間接血凝試劑盒進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示:間接ELISA陽性率為61.46%(59/96),間接血凝試劑盒的陽性率為56.25%(54/96)。貓弓形蟲感染Dot-ELISA檢測(cè)方法的建立本研究利用純化后的弓形蟲SAG3蛋白來進(jìn)行包被,選取硝酸纖維素膜(NC)膜作為固相載體來進(jìn)行試驗(yàn)。最終確定本研究方法中待檢血清的稀釋倍數(shù)達(dá)到1:1600時(shí)為最佳;HRP標(biāo)記山羊抗貓Ig G最佳稀釋度為1:5000;抗原的最佳包被量0.125μg/片;敏感性可達(dá)到1:12800;特異性試驗(yàn)證實(shí),本方法與貓杯狀病毒標(biāo)準(zhǔn)血清和貓傳染性胃腸炎病毒標(biāo)準(zhǔn)血清均無交叉反應(yīng)。對(duì)臨床中96份貓血清樣品進(jìn)行檢測(cè)并與商品化的間接血凝試劑盒進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示,Dot-ELISA試驗(yàn)的陽性率為62.5%(52/96),間接血凝試劑盒的陽性率為56.25%(54/96)。貓弓形蟲感染免疫膠體金試紙條的研制本研究選取檸檬酸三鈉還原氯金酸來制備膠體金溶液。以金顆粒標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)和抗SPA的二抗來組建貓弓形蟲病膠體金試紙條。當(dāng)每毫升膠體金溶液中加入3μL K2CO3(0.2mol/L)混勻后的p H值為最佳;金標(biāo)SPA的最佳標(biāo)記量為6μg/m L,檢測(cè)線(T)質(zhì)控線(C)最佳包被量分別為0.5mg/m L和1mg/m L。對(duì)試紙條進(jìn)行性能試驗(yàn),敏感性可達(dá)1:640,通過檢測(cè)貓杯狀病毒標(biāo)準(zhǔn)血清和貓傳染性胃腸炎病毒標(biāo)準(zhǔn)血清均未出現(xiàn)交叉反應(yīng),選取不同批次的試紙進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)后,重復(fù)性較好。對(duì)不同儲(chǔ)存條件下(室溫、4℃、37℃)及不同保存期(1d、7d、30d、60d、90d、120d)的試紙條進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示4℃保存的效果較好,可達(dá)到120d。室溫加有干燥劑的試紙條保存相對(duì)較好,保存期可達(dá)到90d(可見輕微條帶)。37℃保存的試紙條效果相對(duì)較差,保存期在90d時(shí)已經(jīng)失效。對(duì)臨床中96份貓血清樣品進(jìn)行檢測(cè)并與商品化的間接血凝試劑盒進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示:免疫膠體金檢測(cè)方法的陽性率為57.29%(52/96),間接血凝試劑盒的陽性率為56.25%(54/96)。
[Abstract]:Toxoplasma is a global distribution of zoonotic parasites, about 190100 people infected with toxoplasmosis worldwide each year. The host disease widely, can infect all warm blooded animal and animal health. Temperature populations showed a recessive infection, generally do not have symptoms, but some people suffering from AIDS and immunodeficiency disease symptoms than patients the cat is obvious. The end host is the intermediate host of Toxoplasma gondii. Humans mainly through ingestion of contaminated or undercooked food containing cysts in human and animal infection. Infection in pregnancy usually presents after termination of pregnancy, miscarriage, stillbirth, fetal mummies, weak current diagnostic methods and other symptoms. Toxoplasma mainly includes: etiologic diagnosis, molecular diagnosis, immunological diagnosis. Surface antigens of Toxoplasma gondii (SAG) gene family members more. Including SAG1, SAG2, SAG3 three.SAG3 There are in all stages of Toxoplasma gondii invade host cells, in the size of a member of the 43KDa. family, and SAG3 is most similar to SAG1.SAG1 is the specific antigen of tachyzoites, its good immunogenicity, widely used in the research of nucleic acid vaccine, is believed to be the first choice of.SAG3 and SAG1 of Toxoplasma gondii vaccine prepared with the same the structure and function of the SAG1 report that there are many, but few reports about the SAG3, therefore, this study established SAG3 cat Toxoplasma infection detection method. Indirect ELISA method for detection of Toxoplasma infection in cats established in the study of surface antigen SAG3 of Toxoplasma gondii purified as antigen to establish ELISA detection method for optimizing conditions. Finally, the best coating antigens were: 0.75 g/ hole; the optimal dilution ratio of serum samples to be tested for 1:800; HRP labeled Goat anti cat Ig G the optimal dilution ratio of 1: 5000 min; The sensitivity can reach 1:12800; selection of serum and feline calicivirus standard cat transmissible gastroenteritis virus standard serum specific test results, no cross reaction, the specific test method is better; the 96 hole detection board selects different production date of the inter and intra test results show that the coefficient of variation between batch test and in the test group were less than 6%. to detect 96 clinical samples of cat serum samples, the results and the commercialization of the indirect hemagglutination kit were compared, results showed that the positive rate of indirect ELISA was 61.46% (59/96), the positive rate of indirect hemagglutination kit was 56.25% (54/96). To establish an Dot-ELISA method for detection of Toxoplasma gondii in cats the infection on the induction of SAG3 protein after purification of Toxoplasma gondii were selected on nitrocellulose membrane (NC) membrane as the solid phase carrier to test. The final dilution ratio was determined in this study detected the blood To 1:1600 for the best; HRP labeled Goat anti cat Ig G dilution at 1:5000; the best package was 0.125 g/ antigen; sensitivity can reach 1:12800; confirmed the specificity test, serum and feline calicivirus standard and the method of cat transmissible gastroenteritis virus standard serum and no cross reaction was detected in clinical. In 96 samples of cat serum samples and indirect hemagglutination test kit and commercialization were compared. The results showed that the positive rate of Dot-ELISA test was 62.5% (52/96), the positive rate of indirect hemagglutination kit was 56.25% (54/96). The development of GICA for this study selected three citric acid sodium reducing gold chloride acid to prepare colloidal gold solution to Toxoplasma gondii infected cats. Gold particles labeling staphylococcal protein A (SPA) and anti SPA two antibody to form cat toxoplasmosis colloidal gold strip. When adding 3 L K2CO3 per milliliter of colloidal gold solution (0.2mol/ L) mixed P H value is the best; best marks the gold standard of SPA 6 g/m L (T), the detection line control line (C) the best package is respectively 0.5mg/m L and 1mg/m L. performance test was carried out on the test strip, sensitivity of 1:640 by serum cat and feline calicivirus the standard detection of infectious gastroenteritis virus standard serum showed no cross reaction test, selection of different batches of repeatability, reproducibility of different storage conditions (room temperature, 4 C, 37 C) and different storage period (1D, 7d, 30d, 60d, 90d, 120d) of the test strip test results show good preservation effect of 4 deg C, can reach 120d. at room temperature and strip desiccant remain relatively good, the preservation period can reach 90d (visible light band).37 stored at the test strip is relatively poor, the preservation period has expired at 90d. The 96 clinical samples of cat serum samples detection and commodity The indirect hemagglutination test kit was compared. The results showed that the positive rate of immunogold gold detection method was 57.29% (52/96), and the positive rate of indirect hemagglutination kit was 56.25% (54/96).

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.293

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本文編號(hào)：1729078