本文選題：牛　切入點(diǎn)：多殺性巴氏桿菌　出處：《西南大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)為球桿狀或短桿狀的革蘭氏陰性菌,根據(jù)莢膜抗原主要分為A、B、D、E和F 5種莢膜血清型,根據(jù)菌體抗原分為1~16個(gè)血清型。多殺性巴氏桿菌能夠引起牛羊等多種動(dòng)物的感染,導(dǎo)致急慢性傳染性疾病,其癥狀包括牛出血性敗血癥、牛肺炎、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、禽霍亂、兔出血性敗血癥等。已有文獻(xiàn)報(bào)道,人被犬貓抓傷后感染多殺性巴氏桿菌可引起局部組織損傷,甚至導(dǎo)致全身系統(tǒng)性疾病。該病不僅嚴(yán)重威脅動(dòng)物及人類的身體健康,也給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來,隨著肉牛養(yǎng)殖的發(fā)展,牛多殺性巴氏桿菌病的流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而牛群感染大多以A型多殺性巴氏桿菌所致的牛肺炎為主。多殺性巴氏桿菌毒力因子在致病機(jī)制中占有至關(guān)重要的作用,如粘附素、莢膜、脂多糖、外膜蛋白、鐵調(diào)控蛋白和毒素等。外膜蛋白是外膜中鑲嵌的多種蛋白質(zhì)的總稱,脂蛋白是外膜蛋白的一種,具有粘附宿主、抵御毒素入侵、影響生物膜形成等作用,在細(xì)菌對(duì)宿主的感染和致病過程中起著重要的作用。根據(jù)報(bào)道,脂蛋白E(PlpE)作為重要的毒力因子,具有較好的免疫原性,可作為良好的疫苗候選。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),PM0979蛋白可能是細(xì)胞膜的組成成分,且其重組蛋白具有較好的免疫原性,但目前對(duì)其功能的研究尚不清楚。本研究首先通過生物信息學(xué)軟件分析PM0979的蛋白結(jié)構(gòu)和可能的細(xì)胞定位;同時(shí),采用熒光定量PCR檢測(cè)Pm0979基因的體內(nèi)外表達(dá)情況。其次,通過間接免疫熒光分析其細(xì)胞定位。最后,通過體外實(shí)驗(yàn)研究其刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的能力;同時(shí),以A型多殺性巴氏桿菌為研究對(duì)象,構(gòu)建Pm0979基因的突變株,并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步探究其功能。1.多殺性巴氏桿菌pm0979基因的生物信息學(xué)及體內(nèi)外表達(dá)差異分析本試驗(yàn)利用SignalP-4.1 server及TMHMM Server v2.0在線分析軟件對(duì)PM0979進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示,PM0979蛋白的1-20aa為信號(hào)肽區(qū)域,無跨膜結(jié)構(gòu)域;利用DOLOP在線分析程序以及LipoP 1.0server在線分析軟件對(duì)PM0979蛋白進(jìn)行脂蛋白的預(yù)測(cè)分析,預(yù)測(cè)其為假定的脂蛋白;利用CELLOv.2.5在線分析軟件進(jìn)行Pm0979基因細(xì)胞定位的預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)結(jié)果該蛋白定位在細(xì)胞膜與外膜之間;利用Clustalx1.83分析軟件進(jìn)行Pm0979基因的同源性分析比較,結(jié)果顯示,基因Pm0979在A型菌株和B型菌株中保守性極高,在D型菌株、F型菌株和羊源菌株中存在單堿基的突變,提示PM0979蛋白定位在胞外且與巴氏桿菌多種血清型菌株同源性高。在以上結(jié)果基礎(chǔ)上,以本實(shí)驗(yàn)室不同血清型菌株P(guān)mA、PmB、PmF為模板,通過熒光定量PCR檢測(cè)Pm0979基因的體外表達(dá)情況。結(jié)果顯示,Pm0979基因在PmA、PmB、PmF型菌株的體內(nèi)外均表達(dá)且有一定差異。2.Pm0979基因的原核表達(dá)及其蛋白的細(xì)胞定位分析通過設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增PmCQ2菌株的Pm0979基因,以PET-32a(+)為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白rPM0979。通過超聲波破碎菌體后保留上清,進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及可溶蛋白rPM0979的純化除鹽,制備rPM0979的小鼠血清抗體。以PmCQ2為研究對(duì)象,通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)PM0979蛋白在PmCQ2菌株中的分布特征。結(jié)果顯示透化組的PmCQ2呈現(xiàn)翠綠色熒光信號(hào),未透化組和陰性組的PmCQ2沒有任何信號(hào),表明rPM0979抗體能夠特異地識(shí)別Pm細(xì)胞壁內(nèi)的抗原,并與之發(fā)生免疫反應(yīng),推測(cè)該蛋白可能分布于細(xì)菌的膜上。3.多殺性巴氏桿菌PM0979致病性研究分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,并將可溶蛋白rPM0979與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24h,通過ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性細(xì)胞因子。結(jié)果顯示,rPM0979誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性細(xì)胞因子均上調(diào),TNF-α、IL-6及IL-18的上調(diào)與對(duì)照組相比差異極顯著,IL-1β差異顯著。該結(jié)果提示PM0979可能參與多殺性巴氏桿菌致炎作用。以PmCQ2基因組為模板PCR擴(kuò)增Pm0979基因的上下游同源臂,將其克隆至質(zhì)粒PUC19ori KanR相應(yīng)的酶切位點(diǎn),構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PUC19oriKanR-△0979。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)中,在抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,PCR檢測(cè)及Western blot驗(yàn)證,構(gòu)建PmCQ2菌株的Pm0979基因突變株。檢測(cè)突變株對(duì)生化試驗(yàn),生長(zhǎng)曲線,生物膜形成的影響。結(jié)果顯示,PmCQ2-△0979突變株與野毒株P(guān)mCQ2的生化特性一致;體外37℃培養(yǎng),PmCQ2-△0979突變株生長(zhǎng)速度與野毒株P(guān)mCQ2無差異;值得注意的是,PmCQ2-△0979突變株生物膜形成能力減弱;同時(shí),通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PM0979對(duì)巴氏桿菌毒力的影響,動(dòng)物攻毒試驗(yàn)顯示,PmCQ2-△0979突變株腹腔攻毒小鼠后死亡率為75%,而野生型PmCQ2為100%。說明PmCQ2-△0979突變株毒力減弱;ELISA檢測(cè)PmCQ2-△0979突變株感染巨噬細(xì)胞后炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平,結(jié)果顯示相對(duì)于野生型,TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)無顯著差異。該結(jié)果提示PM0979是多殺性巴氏桿菌的毒力相關(guān)因子,在多殺性巴氏桿菌的致病過程中具有一定作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：1624671