本文選題：梨小食心蟲　切入點(diǎn)：胰蛋白酶活性　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：梨小食心蟲Grapholitha molesta是一種世界性果樹重要害蟲,主要危害桃梢及桃、梨、蘋果等果實(shí),其典型的季節(jié)性轉(zhuǎn)移寄主危害習(xí)性是引起梨小食心蟲常年猖獗成災(zāi)的主要原因。昆蟲中腸胰蛋白酶在昆蟲取食消化和生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。本研究以梨小食心蟲為研究對(duì)象,首先運(yùn)用生化技術(shù)測(cè)定了梨小食心蟲幼蟲中腸蛋白酶的最適pH。在此基礎(chǔ)上,一方面用不同寄主植物飼喂梨小食心蟲,觀察其生長(zhǎng)發(fā)育狀況,同時(shí)測(cè)定胰蛋白酶的活性,初步探明胰蛋白酶的活性在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用及寄主適應(yīng)性。另一方面運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆中腸胰蛋白酶基因,獲得其序列相關(guān)生物學(xué)信息,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定其在取食不同寄主植物的梨小食心蟲體內(nèi)表達(dá)量,初步明確胰蛋白酶在昆蟲消化過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制,為以昆蟲中腸蛋白酶為靶標(biāo)的害蟲防治提供新思路。取得的具體研究結(jié)果如下:(1)運(yùn)用生化技術(shù)獲得在Tris-HCl,KH2PO4/NaOH和Glycine/NaOH 3種緩沖液中,梨小食心蟲幼蟲中腸總蛋白酶最適pH分別為10.5、11.0和11.0,強(qiáng)堿性胰蛋白酶的最適pH分別為10.5、11.0和11.0,弱堿性胰蛋白酶的最適pH分別為8.5、9.0和9.0。(2)收集從田間采集到的桃梢、梨、木瓜、蘋果(秦冠)4種寄主植物和人工飼料飼養(yǎng)的蟲源取食蘋果(秦冠)、蘋果(嘎啦)、海棠、毛桃、油桃、李6種寄主果實(shí)的梨小食心蟲不同齡期幼蟲,發(fā)現(xiàn)其中腸總蛋白酶、強(qiáng)堿性胰蛋白酶、弱堿性胰蛋白酶活性存在差異顯著。從田間4種寄主植物上采集到的梨小食心蟲中腸3種蛋白酶活性均表現(xiàn)為4齡3齡5齡,其中從寄主梨上采集的梨小食心蟲3種蛋白酶活性最高,其次為木瓜。室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食6種不同寄主,其總蛋白酶活性在4齡差異顯著;強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性差異顯著,活性表現(xiàn)為4齡3齡5齡;弱堿性胰蛋白酶活性無(wú)差異。室內(nèi)人工飼料飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食蘋果(秦冠)的總蛋白酶和強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性大于取食蘋果(嘎啦)的活性。從田間寄主蘋果(秦冠)上采集的梨小食心蟲總蛋白酶和強(qiáng)堿性胰蛋白酶活性小于用人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食蘋果(秦冠)寄主的活性。(3)室內(nèi)觀察人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食蘋果(秦冠)、蘋果(嘎啦)、海棠、毛桃、油桃、李6種寄主果實(shí)及從田間寄主蘋果(秦冠)上采集梨小食心蟲取食蘋果(秦冠)的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖狀況,發(fā)現(xiàn)其在不同寄主植物間存在顯著性差異。人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食毛桃,其幼蟲期(9.79 d)、成蟲期(11.16 d)、幼蟲-成蟲總歷期(29.09 d)、幼蟲存活率(38.66%)、羽化率(68.86%)、產(chǎn)卵量(50.0粒)和蛹重(8.96 mg)都比較低,但內(nèi)稟增長(zhǎng)率rm較大;取食寄主蘋果(秦冠)的梨小食心蟲的化蛹率(98.13%)和單雌產(chǎn)卵量(67.8粒)大于取食寄主蘋果(嘎啦);取食寄主李的梨小食心蟲的單雌產(chǎn)卵量(110.6粒)最高;取食寄主蘋果的單雌產(chǎn)卵量高于取食桃果。李是梨小食心蟲最適宜的寄主。(4)利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆出GMtrypsin-1與GMtrypsin-2兩個(gè)梨小食心蟲幼蟲中腸胰蛋白酶基因,其長(zhǎng)度分別為861 bp和923 bp,分別編碼257和259個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量分別為27.98 kDa和27.93 kDa。氨基酸序列分析表明2個(gè)基因翻譯出的蛋白均含信號(hào)肽、催化三聯(lián)體His-Asp-Ser以及末端高度保守區(qū)RIVGG和GDSGGP,這些結(jié)構(gòu)與胰蛋白酶所具有的特征一致。氨基酸序列同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)基因GMtrypsin-1與大豆食心蟲Leguminivora glycinivorella的親緣關(guān)系較近,而基因GMtrypsin-2與其它鱗翅目昆蟲親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲幼蟲中腸內(nèi)胰蛋白酶基因GMtrypsin-1與GMtrypsin-2在取食不同寄主的梨小食心蟲體內(nèi)表達(dá)量存在顯著差異。在4齡時(shí)的表達(dá)量3齡5齡。從田間寄主蘋果(秦冠)上采集梨小食心蟲的GMtrypsin-1表達(dá)量高于人工飼料飼養(yǎng)梨小食心蟲取食蘋果(秦冠),而GMtrypsin-2表達(dá)量低于后者。人工飼料飼養(yǎng)梨小食心蟲取食蘋果(秦冠),其2個(gè)基因的表達(dá)量均低于取食蘋果(嘎啦)。從田間寄主桃樹梢上采集的梨小食心蟲、人工飼料飼養(yǎng)取食蘋果(嘎啦)和油桃的梨小食心蟲幼蟲,2個(gè)基因的表達(dá)量都較高。(6)綜合分析表明:胰蛋白酶活性影響梨小食心蟲歷期、蛹重、羽化率及產(chǎn)卵量等參數(shù),促進(jìn)梨小食心蟲的生長(zhǎng)發(fā)育。梨小食心蟲中腸蛋白酶活性和胰蛋白酶基因表達(dá)量均表現(xiàn)為4齡3齡5齡。人工飼養(yǎng)的梨小食心蟲取食寄主李的GMtrypsin-2表達(dá)量最高,蛋白酶活性高且生長(zhǎng)發(fā)育良好,三者之間呈正相關(guān),但也存在個(gè)別特殊現(xiàn)象,說(shuō)明胰蛋白酶活性、表達(dá)量在不同寄主上和同一寄主不同品種間存在差異,這些差異與梨小食心蟲的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S433

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本文編號(hào)：1621504