本文選題：鐵皮石斛　切入點(diǎn)：多糖　出處：《福建農(nóng)林大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鐵皮石斛(Dendrobium officinale),是蘭科石斛屬藥用植物,有著非常獨(dú)特的價(jià)值。本研究以鐵皮石斛原球莖為材料,探討了有利于原球莖增殖、保存及多糖積累的最佳培養(yǎng)條件,并初步建立液體培養(yǎng)系,以測(cè)定其在不同晝夜溫差下的多糖含量,在此基礎(chǔ)上克隆了多糖合成途徑中的2個(gè)關(guān)鍵的糖基轉(zhuǎn)移酶基因—DoGAUT1和DoPGSIP6基因,并對(duì)該基因在不同晝夜溫差下進(jìn)行定量表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下：1鐵皮石斛離體培養(yǎng)條件的優(yōu)化選取鐵皮石斛的原球莖為材料,優(yōu)化鐵皮石斛原球莖增殖與保存的離體培養(yǎng)條件。①采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),比較了6-BA、椰乳、土豆配合使用對(duì)原球莖增殖的影響,試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出1/2 MS+土豆泥50g/L較適合鐵皮石斛原球莖增殖,添力(?)2.0 mg/L 6-BA后,原球莖鮮重增殖系數(shù)增高,但原球莖部分分化。②改變1/2 MS中KNO3、KH2PO4的比例,比較其對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)KNO3, KH2PO4分別為對(duì)照的0.5倍,1倍時(shí),鐵皮石斛原球莖增殖系數(shù)雖最高,但原球莖少量黃化,對(duì)照1/2 MS較適合鐵皮石斛原球莖增殖。③對(duì)比不同的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮配比對(duì)鐵皮石斛原球莖增殖效果的影響,試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)KNO3, NH4NO3均為對(duì)照的0.5倍且土豆泥為50g/L的培養(yǎng)基和1/2 MS+土豆泥50 g/L增殖系數(shù)相最高。④比較不同濃度的姜黃素和甜菜紅苷對(duì)鐵皮石斛原球莖離體保存的效果的影響,結(jié)果顯示姜黃素為0.1-1.0g/L可以抑制原球莖生長(zhǎng),甜菜紅苷濃度為0.1g/L保存效果最好。⑤以誘導(dǎo)出的鐵皮石斛原球莖為材料,接種1/2 MS+土豆提取液50g/L的液體培養(yǎng)基中,比較了不同時(shí)間下鐵皮石斛培養(yǎng)物生物量的變化,試驗(yàn)結(jié)果表明,在整個(gè)生育期內(nèi),原球莖的鮮重變化曲線為S型,30-40 d快速生長(zhǎng)。2鐵皮石斛離體培養(yǎng)物在不同晝夜溫差處理?xiàng)l件下多糖含量變化以誘導(dǎo)出的鐵皮石斛原球莖為材料,比較了不同時(shí)間下鐵皮石斛培養(yǎng)物多糖的變化,在整個(gè)生長(zhǎng)周期,原球莖多糖變化曲線呈S型。選取培育30 d的鐵皮石斛原球莖為材料,對(duì)比了鐵皮石斛多糖含量在不同晝夜溫差下的差異。試驗(yàn)結(jié)果表明,處理溫度為25℃/10℃,處理2d的多糖含量最高,且在一定的處理時(shí)間范圍內(nèi),多糖含量先增加后下降的趨勢(shì)；處理溫度為25℃/15℃,該溫度下多糖的含量隨著處理時(shí)間的增加而增加,該溫差是最適合促進(jìn)次生代謝物多糖積累的溫度；處理溫度為25℃/20℃,多糖含量呈遞增趨勢(shì),略低于相同時(shí)間下溫度為25℃/15℃的處理。3鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆及生物信息學(xué)分析應(yīng)用同源克隆與RACE技術(shù)結(jié)合,以鐵皮石斛原球莖為材料,克隆了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因DoGAUT1和DoPGSIP6,全長(zhǎng)分別為2518、2010 bp,分別編碼了705、549個(gè)氨基酸,登入號(hào)為1740985。生物信息學(xué)研究表明,DoGAUT1為親水性跨膜蛋白,不含信號(hào)肽,形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu),亞細(xì)胞定位于高爾基體。DoPGSIP6為疏水性跨膜蛋白,含信號(hào)肽,無(wú)卷曲螺旋結(jié)構(gòu),亞細(xì)胞定位于質(zhì)膜。它們同屬于GT8家族中的GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶,DoGAUT1蛋白在第394-692位含有典型的GT8_like_1未知功能的保守結(jié)構(gòu)域,多個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。而DoPGSIP6蛋白在第29-276位含有GT8_Glycogenin保守結(jié)構(gòu)域,多個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)錳結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)保守基因序列DXD,該基序主要負(fù)責(zé)將不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上。此外,DoPGSIP6蛋白在第448-522位含有CCC1_like保守結(jié)構(gòu)域,它可能具有固氮的作用。進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列分別與二穗短柄草,大豆進(jìn)化關(guān)系最近,而與番茄、甜橙親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。4鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6基因在不同晝夜溫差下的定量表達(dá)分析以18S rRNA為內(nèi)參基因,對(duì)DoGAUT1基因和DoPGSIP6基因在不同晝夜溫差下的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),晝夜溫度為25℃/15℃時(shí),DoGAUT1基因和DoPGSIP6基因表達(dá)水平與多糖含量呈正相關(guān)。DoPGSIP6在晝夜溫差為15℃時(shí),處理2d,DoPGSIP6基因相對(duì)表達(dá)量和多糖的含量均達(dá)到該溫差處理?xiàng)l件下的最高水平。
[Abstract]:Dendrobium (Dendrobium officinale), is the orchid Dendrobium, has a very unique value. In this study, the tin Shi Huyuan bulbs as materials, discussed in favor of protocorm proliferation, preservation and accumulation of polysaccharides in the optimum culture conditions, and to establish a liquid culture system, to determine the content of polysaccharides in different the temperature difference between day and night, based on the cloning of 2 key glycosyl polysaccharide biosynthesis transferase gene DoGAUT1 and DoPGSIP6 gene, and the gene quantitative expression analysis in different temperature. The main results are as follows: 1 Dendrobium officinale from optimization of culture conditions of selected body of Dendrobium candidum protocorm material conditions in vitro optimization of protocorm proliferation and preservation. The single factor experiment, compared with 6-BA, coconut milk, potatoes with effect on the protocorm proliferation test. The data that 1/2 MS+ Mashed Potato 50g/L is suitable for protocorm proliferation, Tim (?) 2 mg/L 6-BA, increased fresh weight of protocorm proliferation coefficient, but part of protocorm differentiation. The change of KNO3 1/2 in MS, the ratio of KH2PO4, compare the protocorm proliferation effect of test results show that when KNO3, KH2PO4 were 0.5 times, 1 times, protocorm proliferation coefficient was the highest, but a small amount of protocorm chlorosis, control 1/2 MS is suitable for protocorm proliferation. The effect of the comparison of different nitrate nitrogen and ammonium nitrogen ratio on the iron skin effect of protocorm multiplication of Dendrobium the test results show that when KNO3, NH4NO3 are 0.5 times than the control and Mashed Potato 50g/L medium and 1/2 MS+ Mashed Potato 50 g/L. The highest proliferation coefficient of different concentrations of curcumin and red beet glycosides on protocorm in vitro preservation effect The results showed that curcumin, 0.1-1.0g/L can inhibit the growth of protocorms, red beet glycoside concentration is 0.1g/L the best preservation effect. Based on the induced protocorm were inoculated with 1/2 MS+ potato extract 50g/L liquid medium, compared the change of biomass under different cultivation time of iron Dendrobium, test the results show that in the whole growth period, fresh weight change curve of protocorm of type S and 30-40 D.2 rapid growth of Dendrobium officinale in vitro culture in different dif conditions to induce changes of polysaccharide content of Dendrobium candidum protocorms as materials, studied under different time multi culture of Dendrobium candidum sugar, in the whole growth period, the curve of protocorm polysaccharide changes were S type. Select 30 d cultivation of Dendrobium protocorm as materials, compared the difference of Dendrobium officinale polysaccharide content in different temperature difference between day and night under test. The results show that the processing temperature is 25 DEG /10 DEG 2D, the polysaccharide content is the highest, and the processing time in a certain range, the polysaccharide content increased first and then decreased; with the temperature of 25 DEG /15 DEG C, the temperature of polysaccharide content increased with the increase of processing time, the temperature difference is the most suitable for the promotion of secondary metabolites accumulation of polysaccharide temperature; processing temperature is 25 DEG /20 DEG, presenting the polysaccharide content increased, slightly lower than the same time under the temperature of 25 DEG /15 DEG.3 protocorm DoGAUT1 and DoPGSIP6 gene cloning and bioinformatic analysis using homologous cloning and combined with RACE technology with protocorms as materials, cloned two glycosyltransferase genes DoGAUT1 and DoPGSIP6 in length were 25182010 BP, 705549 amino acids respectively encoding, lander on 1740985. bioinformatics showed that DoGAUT1 Pro Water transmembrane protein without signal peptide, forming a coiled coil structure, subcellular localization in Golgi.DoPGSIP6 was a hydrophobic transmembrane protein containing the signal peptide, no coiled coil structure, subcellular localization at the plasma membrane. They belong to the GT8 family of glycosyl transferase GT- in a conserved DoGAUT1 domain containing protein. Typical GT8_like_1 of unknown function in section 394-692 of the plurality of ligand binding sites, 2 metal binding sites. DoPGSIP6 protein contains a conserved GT8_Glycogenin domain in section 29-276, a plurality of substrate binding sites, 2 manganese binding sites and a conserved sequence of DXD gene, the motif is mainly responsible for the addition of different the sugar to the sugar chain, carbonate, protein. In addition, DoPGSIP6 protein contains a conserved CCC1_like domain in section 448-522, it may have the role of nitrogen fixation. Phylogenetic tree revealed DoGAUT1 and DoPGSIP6 gene The deduced amino acid sequence respectively with two distachyon, recent soybean evolution, and tomato, expression analysis with 18S rRNA as a reference gene quantitative orange distantly related.4 Dendrobium DoGAUT1 and DoPGSIP6 gene in different day and night temperature difference, the expression level of DoGAUT1 gene and DoPGSIP6 gene in the different temperature difference between day and night the relative quantitative expression analysis. The results showed that diurnal temperature of 25 DEG /15 DEG C, DoGAUT1 and DoPGSIP6 gene expression level was positively correlated with the content of polysaccharide in the.DoPGSIP6 diurnal temperature is 15 degrees centigrade, 2D, the relative expression of DoPGSIP6 gene and polysaccharide contents reached the highest level under the condition of temperature.

【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S567.239

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本文編號(hào)：1590146