本文關(guān)鍵詞： 高通量測(cè)序 長(zhǎng)片段PCR 牡蠣皰疹病毒 鮑皰疹病毒　出處：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：20世紀(jì)70年代美國(guó)首次出現(xiàn)皰疹病毒感染軟體動(dòng)物(一批養(yǎng)殖試驗(yàn)用美洲牡蠣)的案例,但并未對(duì)當(dāng)?shù)睾腿蚱渌貐^(qū)牡蠣和貝類養(yǎng)殖業(yè)造成損害。然而進(jìn)入90年代后,皰疹病毒感染引起的牡蠣、扇貝、蛤類和鮑等貝類的死亡案例在全球范圍內(nèi)(主要包括歐洲、美國(guó)、澳洲以及我國(guó))頻繁發(fā)生,給當(dāng)?shù)刎愵愷B(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)形態(tài)學(xué)電鏡觀察、病毒分離純化和全基因組測(cè)序比對(duì)后,兩種新皰疹病毒:牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)和鮑皰疹病毒(Haliotid herpesvirus 1,Ha HV-1)被相繼鑒定出來(lái)。Os HV-1和Ha HV-1同隸屬于軟體動(dòng)物皰疹病毒科(Malacoherpesviridae),是該病毒科下唯一已知的兩個(gè)病毒種。Os HV-1屬于牡蠣皰疹病毒屬(Ostreavirus),可感染多種雙殼貝類;Ha HV-1屬于鮑皰疹病毒屬(Aurivirus),感染單殼貝類。隨時(shí)間的發(fā)展,OsHV-1也發(fā)生了較強(qiáng)的株系分化。但受制于技術(shù)所限,對(duì)不同年代變異株基因組序列信息的掌握甚少。本研究嘗試?yán)没陂L(zhǎng)片段PCR方法的貝類皰疹病毒基因組富集技術(shù),對(duì)低溫凍存的多年份櫛孔扇貝及魁蚶感染OsHV-1和九孔鮑感染Ha HV-1的基因組進(jìn)行富集,使用高通量測(cè)序技術(shù)獲取Os HV-1不同變異株序列信息,并分析了不同變異株與其他變異株的基因組變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究方法及部分結(jié)果如下:第一部分:建立一套對(duì)于長(zhǎng)期低溫凍存貝類病料樣本中牡蠣皰疹病毒的基因組富集方法,通過(guò)病毒懸液法提取病毒基因組DNA,根據(jù)參考基因組(207,439 bp)設(shè)計(jì)23對(duì)引物,使用Takara高保真聚合酶GXL擴(kuò)增了2001年份凍存的櫛孔扇貝牡蠣皰疹病毒全基因組,并使用Illumina Hiseq PE2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行第二代測(cè)序;同時(shí)使用PacBio RS II系統(tǒng)進(jìn)行第三代高通量測(cè)序(SMRT)。第二代測(cè)序共獲得8個(gè)Scaffolds,分別為170,095、18,675、1929、1805、1395、834、825和600 bp。第三代測(cè)序獲得117,873個(gè)clean subreads,平均長(zhǎng)度7202 bp。組裝后對(duì)于基因組末端序列以及有問(wèn)題的區(qū)域通過(guò)Sanger測(cè)序以及二代測(cè)序作進(jìn)一步驗(yàn)證。修補(bǔ)后獲得長(zhǎng)204,783 bp的全基因組序列�；�11個(gè)OsHV-1變異株的32個(gè)ORF基礎(chǔ)上進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示,2001年份分離的Os HV-1變異株與2009年分離自我國(guó)櫛孔扇貝的AVNV親緣關(guān)系最近,而與2008年以后出現(xiàn)的OsHV-1μvar及其相關(guān)變異株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。Os HV-1變異株間的親緣關(guān)系受到宿主及時(shí)空分布范圍的影響。研究表明,本試驗(yàn)建立的OsHV-1基因組富集方法易用且有效。第二部分:利用新建立的從凍存貝類病料中擴(kuò)增牡蠣皰疹病毒基因組的富集方法,成功擴(kuò)增了多年份櫛孔扇貝病料(2002年、2003年、2004年、2008年)及2015年魁蚶病料中OsHV-1的基因組。構(gòu)建小片段文庫(kù),通過(guò)Illumina Hiseq PE2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序并進(jìn)行變異序列分析。多年份病毒株第二代測(cè)序分別獲得長(zhǎng)度為180,686bp、182,857 bp、190,414 bp、173,253 bp和192,676 bp的基因組。測(cè)序序列GC含量分別為38.6%(ZK2002)、38.8%(ZK2003)、38.9%(ZK2004)、38.8%(ZK2008)、38.5%(KH2015)。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示多年份櫛孔扇貝OsHV-1變異株與AVNV親緣關(guān)系最近,而與2008年以后出現(xiàn)的OsHV-1μvar及其相關(guān)變異株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2015年OsHV-1魁蚶株與2012年分離自我國(guó)魁蚶的Os HV-1-SB親緣關(guān)系最近。本研究建立的基因組富集方法可以適用于OsHV-1不同變異株基因組的富集,并進(jìn)行后續(xù)的變異序列分析。第三部分:參照新建立的從凍存貝類病料中擴(kuò)增牡蠣皰疹病毒基因組的富集方法,建立起擴(kuò)增鮑皰疹病毒基因組富集方法。通過(guò)病毒懸液法提取病毒基因組DNA,根據(jù)參考基因組設(shè)計(jì)引物,使用Takara高保真聚合酶GXL擴(kuò)增了2016年份鮑皰疹病毒基因組,瓊脂糖凝膠電泳顯示,成功獲得21個(gè)長(zhǎng)9~13 kbp的目的條帶。本研究建立的基因組富集方法可以適用于Ha HV-1變異株基因組的富集,并進(jìn)行后續(xù)的變異序列分析。
[Abstract]:In this study , we used high - throughput sequencing technology to extract the genomic DNA of oyster - herpesviruses ( Ostreid - 1 , OsHV - 1 ) and abalone ( Haliotid ) . The genetic relationship between OsHV - 1 and OsHV - 1渭var and its associated mutants was analyzed . The results showed that OsHV - 1 strain isolated in 2001 was closely related to the genetic relationship of OsHV - 1 渭var and its associated mutants .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S944

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