本文關鍵詞： 草魚 ATF6 XBP1S GRP78 GRP94 轉(zhuǎn)錄調(diào)控　出處：《南昌大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：ATF6和XBP1S是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的重要的堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)結合型轉(zhuǎn)錄因子,屬于CREB/ATF(cAMP應答元件結合蛋白)蛋白家族成員。他們均是未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)信號通路的關鍵調(diào)控因子,通過調(diào)控UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控細胞適應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的保護性蛋白。當細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應激狀態(tài)時,細胞內(nèi)將先產(chǎn)生一種ATF6核內(nèi)活性形式(ATF6N),ATF6N通過內(nèi)網(wǎng)應激反應順式元件(ERSE)激活葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的表達(主要是GRP78和GRP94)和激活未剪切的XBP1(unspliced XBP1,XBP1U)mRNA。同時IRE1α發(fā)生二聚化及磷酸化后就在XBP1U m RNA的特定內(nèi)含子-外顯子區(qū)域剪切掉26個核苷酸,導致開放閱讀框移動編碼更長的XBP1(spliced XBP1,XBP1S)。XBP1S進入細胞核內(nèi),激活ER應激反應中的相關蛋白及ERAD,從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài),促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)平衡。為了了解魚類ATF6作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對下游靶基因的調(diào)控機制,我們克隆了草魚ATF6的全長序列(KT279356),分析其蛋白結構,發(fā)現(xiàn)其N端含有一個非常保守的BRLZ結構域。同時,克隆了草魚GRP78和GRP94啟動子序列。通過熒光定量PCR實驗,我們分析了CiATF6在不同組織及衣霉素刺激作用下的表達特性。實驗結果表明CiATF6在所測組織中均有表達,且在肝臟組織中表達量最高;同時衣霉素刺激草魚腎細胞(CIK細胞),也能上調(diào)CiATF6的表達。原核表達了CiATF6N,鎳柱親和層析獲得純化蛋白。體外凝膠阻滯實驗顯示純化的體外重組蛋白Ci ATF6N對CiGRP78和CiGRP94啟動子片段有明顯的阻滯效果,說明CiATF6是CiGRP78和CiGRP94潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。之后,我們構建了真核表達載體pcDNA3.1-CiATF6和pcDNA3.1-CiATF6-nBRLZ,與pGL-CiGRP78P和pGL-CiGRP94P瞬時共轉(zhuǎn)染至CIK細胞,發(fā)現(xiàn)CiATF6能顯著上調(diào)CiGRP78P和CiGRP94P的熒光素酶活性。為進一步研究草魚ATF6對XBP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,我們克隆了長度為1036 bp的CiXBP1的啟動子,同時克隆了CiXBP1S基因的全長。通過熒光定量PCR實驗,我們分析了CiXBP1S在不同組織及衣霉素刺激作用下的表達特性。實驗結果表明CiXBP1S在所測組織中均有表達,且在肝臟組織中表達量最高;衣霉素刺激草魚CIK細胞,發(fā)現(xiàn)衣霉素能上調(diào)CiXBP1S的表達。利用在線軟件分析發(fā)現(xiàn)CiXBP1的啟動子含有一個及其保守的ERSE元件,我們構建了pGL-CiXBP1P及其突變體pGL-CiXBP1P-P1和pGL-CiXBP1P-P2熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒,雙熒光素酶活性實驗分析,發(fā)現(xiàn)pGL-CiXBP1P及pGL-CiXBP1P-P2具有高啟動子活性,而pGL-CiXBP1P-P1幾乎沒有活性。同時分析CiXBP1S的蛋白結構,同樣發(fā)現(xiàn)其N端含有一個BRLZ結構域,原核表達并獲得了CiXBP1S及其突變體CiXBP1S-nBRLZ蛋白。體外凝膠阻滯實驗發(fā)現(xiàn)CiATF6N對pGL-CiXBP1P-P2有阻滯效果,而對pGL-CiXBP1P-P1沒有此現(xiàn)象。同時,我們發(fā)現(xiàn)CiXBP1S也有同樣的現(xiàn)象。雙熒光素酶活性實驗進一步證實了CiATF6能激活CiXBP1的轉(zhuǎn)錄,更有趣的是我們發(fā)現(xiàn)Ci XBP1S能上調(diào)pGL-CiXBP1P-P2的雙熒光素酶活性值,對pGL-CiXBP1P-P1也沒有此現(xiàn)象,表明CiXBP1S具有自調(diào)控功能。為了探索CiXBP1S對CiGRP78和CiGRP94轉(zhuǎn)錄調(diào)控,體外凝膠阻滯實驗分析其與CiGRP78和CiGRP94啟動子片段的親和性,發(fā)現(xiàn)CiXBP1S對CiGRP78和CiGRP94啟動子片段具有顯著地阻滯現(xiàn)象,同時發(fā)現(xiàn)CiXBP1S-nBRLZ卻沒有此現(xiàn)象,表明Ci XBP1S的BRLZ結構域?qū)ζ湔{(diào)控下游靶基因非常重要。進一步的雙熒光素酶活性實驗結果也證實了這一點,CiXBP1S能顯著上調(diào)CiGRP78和CiGRP94啟動子的活性,而CiXBP1S-nBRLZ卻不能。
[Abstract]:ATF6 and XBP1S are important basic leucine zipper ( bZIP ) binding transcription factors related to endoplasmic reticulum stress , belonging to the family members of the CREB / ATF ( cAMP response element binding protein ) protein family . They are the key regulatory factors of unfolded protein response ( UPR ) signaling pathway . In order to study the expression of CiATF6 in different tissues and CigrP94 promoter fragments , we cloned the promoter of CiXBP1S gene . The results showed that CiATF6 could increase the expression of CiXBP1S in different tissues and CiGRP94 .

【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：1524461