本文關(guān)鍵詞： 草魚 ATF6 XBP1S GRP78 GRP94 轉(zhuǎn)錄調(diào)控　出處：《南昌大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：ATF6和XBP1S是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的重要的堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子,屬于CREB/ATF(cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白)蛋白家族成員。他們均是未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子,通過調(diào)控UPR靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)性蛋白。當(dāng)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),細(xì)胞內(nèi)將先產(chǎn)生一種ATF6核內(nèi)活性形式(ATF6N),ATF6N通過內(nèi)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)順式元件(ERSE)激活葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)(主要是GRP78和GRP94)和激活未剪切的XBP1(unspliced XBP1,XBP1U)mRNA。同時(shí)IRE1α發(fā)生二聚化及磷酸化后就在XBP1U m RNA的特定內(nèi)含子-外顯子區(qū)域剪切掉26個(gè)核苷酸,導(dǎo)致開放閱讀框移動(dòng)編碼更長的XBP1(spliced XBP1,XBP1S)。XBP1S進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),激活ER應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)蛋白及ERAD,從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)平衡。為了了解魚類ATF6作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)下游靶基因的調(diào)控機(jī)制,我們克隆了草魚ATF6的全長序列(KT279356),分析其蛋白結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其N端含有一個(gè)非常保守的BRLZ結(jié)構(gòu)域。同時(shí),克隆了草魚GRP78和GRP94啟動(dòng)子序列。通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),我們分析了CiATF6在不同組織及衣霉素刺激作用下的表達(dá)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CiATF6在所測組織中均有表達(dá),且在肝臟組織中表達(dá)量最高;同時(shí)衣霉素刺激草魚腎細(xì)胞(CIK細(xì)胞),也能上調(diào)CiATF6的表達(dá)。原核表達(dá)了CiATF6N,鎳柱親和層析獲得純化蛋白。體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示純化的體外重組蛋白Ci ATF6N對(duì)CiGRP78和CiGRP94啟動(dòng)子片段有明顯的阻滯效果,說明CiATF6是CiGRP78和CiGRP94潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。之后,我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CiATF6和pcDNA3.1-CiATF6-nBRLZ,與pGL-CiGRP78P和pGL-CiGRP94P瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染至CIK細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CiATF6能顯著上調(diào)CiGRP78P和CiGRP94P的熒光素酶活性。為進(jìn)一步研究草魚ATF6對(duì)XBP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,我們克隆了長度為1036 bp的CiXBP1的啟動(dòng)子,同時(shí)克隆了CiXBP1S基因的全長。通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),我們分析了CiXBP1S在不同組織及衣霉素刺激作用下的表達(dá)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CiXBP1S在所測組織中均有表達(dá),且在肝臟組織中表達(dá)量最高;衣霉素刺激草魚CIK細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)衣霉素能上調(diào)CiXBP1S的表達(dá)。利用在線軟件分析發(fā)現(xiàn)CiXBP1的啟動(dòng)子含有一個(gè)及其保守的ERSE元件,我們構(gòu)建了pGL-CiXBP1P及其突變體pGL-CiXBP1P-P1和pGL-CiXBP1P-P2熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)pGL-CiXBP1P及pGL-CiXBP1P-P2具有高啟動(dòng)子活性,而pGL-CiXBP1P-P1幾乎沒有活性。同時(shí)分析CiXBP1S的蛋白結(jié)構(gòu),同樣發(fā)現(xiàn)其N端含有一個(gè)BRLZ結(jié)構(gòu)域,原核表達(dá)并獲得了CiXBP1S及其突變體CiXBP1S-nBRLZ蛋白。體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CiATF6N對(duì)pGL-CiXBP1P-P2有阻滯效果,而對(duì)pGL-CiXBP1P-P1沒有此現(xiàn)象。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)CiXBP1S也有同樣的現(xiàn)象。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CiATF6能激活CiXBP1的轉(zhuǎn)錄,更有趣的是我們發(fā)現(xiàn)Ci XBP1S能上調(diào)pGL-CiXBP1P-P2的雙熒光素酶活性值,對(duì)pGL-CiXBP1P-P1也沒有此現(xiàn)象,表明CiXBP1S具有自調(diào)控功能。為了探索CiXBP1S對(duì)CiGRP78和CiGRP94轉(zhuǎn)錄調(diào)控,體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析其與CiGRP78和CiGRP94啟動(dòng)子片段的親和性,發(fā)現(xiàn)CiXBP1S對(duì)CiGRP78和CiGRP94啟動(dòng)子片段具有顯著地阻滯現(xiàn)象,同時(shí)發(fā)現(xiàn)CiXBP1S-nBRLZ卻沒有此現(xiàn)象,表明Ci XBP1S的BRLZ結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湔{(diào)控下游靶基因非常重要。進(jìn)一步的雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),CiXBP1S能顯著上調(diào)CiGRP78和CiGRP94啟動(dòng)子的活性,而CiXBP1S-nBRLZ卻不能。
[Abstract]:ATF6 and XBP1S are important basic leucine zipper ( bZIP ) binding transcription factors related to endoplasmic reticulum stress , belonging to the family members of the CREB / ATF ( cAMP response element binding protein ) protein family . They are the key regulatory factors of unfolded protein response ( UPR ) signaling pathway . In order to study the expression of CiATF6 in different tissues and CigrP94 promoter fragments , we cloned the promoter of CiXBP1S gene . The results showed that CiATF6 could increase the expression of CiXBP1S in different tissues and CiGRP94 .

【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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2 楊海燕;劉新偉;馬亞飛;王群英;劉柳;;低pH液復(fù)灌對(duì)兔缺血再灌注心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的影響研究[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2011年01期

3 吳初新;劉毅;馬梅生;王麗坤;胡成鈺;;熱休克、Poly I:C上調(diào)草魚GRP78基因表達(dá)[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2009年06期

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1 谷美慧;草魚IRF-2下調(diào)IFN、PKR、PKZ轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制[D];南昌大學(xué);2015年

2 彭少卿;鯉Xbp1基因克隆及其免疫功能的初步研究[D];山東師范大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1524461