本文關(guān)鍵詞： 雞 腸上皮細胞 維生素D 脂多糖 β-防御素　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是先天免疫反應的效應分子,其在保護機體免受病原菌威脅的過程中作用顯著。AMPs具有廣譜的抗細菌、真菌、病毒以及支原體活性,其表達分為固定表達和誘導表達且受免疫應激類因子和營養(yǎng)因子類調(diào)控,如脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和維生素D。家禽主要包含兩大類AMPs分子,即β-防御素和cathelicidins,其中β-防御素14種、cathelicidins4種。在人、小鼠以及牛等哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)維生素D對AMPs有調(diào)控作用,提示可通過營養(yǎng)因素提高機體β-防御素的表達從而提高機體對外界病原的抵抗力進而達到減少抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的應用的目的。家禽中是否存在這種調(diào)節(jié)機制尚未見報道。腸道在擔負消化和吸收功能的同時還具有免疫功能,是研究維生素D在免疫應激條件下對其β-防御素基因表達的影響的理想模型。本研究中我們優(yōu)化了雞腸上皮原代細胞分離、培養(yǎng)的條件。結(jié)果表明：15日齡的雞胚的腸道組織更適用于腸上皮細胞的分離、培養(yǎng)；采用多次少時的消化策略得到的健全的腸隱窩集團更多、活力更強,對雞胚的利用率大大提高；采用細胞篩區(qū)分隱窩和單個細胞從而對腸上皮細胞進行純化所耗時間大為減少、純度更高,純度可達到85%以上；腸上皮原代細胞培養(yǎng)24 h-48 h進入對數(shù)增長期,72 h后細胞界限模糊,開始出現(xiàn)凋亡。設置不同濃度的LPS (0.50、100、200、400、800 μg/mL)和維生素D(00.2、2、20、200 ng/mL)處理對數(shù)生長期的腸上皮原代細胞。結(jié)果表明：低濃度的LPS不能引起腸上皮細胞的免疫反應,800 μg/mL的LPS能顯著提高TLR4、IL-1和IL-6的表達,即選取800 μg/mL的LPS處理作為激活雞腸上皮細胞免疫反應的有效濃度;單獨添加維生素D對腸上皮細胞表達VDR、IL-1和IL-6的表達無顯著作用,但在添加LPS的基礎上,其能顯著提高VDR的表達、顯著降低IL-I和IL-6的表達,表明維生素D能抑制由LPS引起的炎性反應,且這種抑制作用隨維生素D的濃度升高而加強。綜合考慮,選取20μg/mL為維生素D的處理濃度。以篩選的LPS濃度和VD濃度處理雞腸上皮原代細胞。結(jié)果表明,LPS能顯著提高GAL-1、GAL-3、GAL-4、GAL-5、GAL-6、GAL-9、GAL-10、GAL-12和GAL-13的表達；維生素D能顯著提高GAL-3、GAL-4、GAL-5、GAL-6和GAL-9的表達,但這種作用僅在免疫應激條件下才有所體現(xiàn)；對14種雞β-防御素基因啟動子區(qū)域進行分析發(fā)現(xiàn)有7種含有VDRE位點,其中6種受到維生素D的調(diào)控。總之,維生素D在腸上皮細胞處于免疫應激條件下能提高β-防御素的表達,且維生素D對β-防御素的調(diào)控作用可能與其啟動子區(qū)的VDRE有關(guān),但具體機制還需要進一步驗證。
[Abstract]:Antimicrobial peptide (AMPs) is the effector of innate immune response. AMPs has a broad spectrum of antimicrobial, fungal, viral and mycoplasma activities. Its expression can be divided into fixed expression and induced expression, which is regulated by immune stress factor and nutrition factor, such as lipopolysaccharide. Poultry consists of two main classes of AMPs molecules, 尾 -defensin and cathelicidins, of which 14 are 尾 -defensins. Cathelicidins4 species. Vitamin D has been found to regulate AMPs in mammals such as humans, mice and cattle. It is suggested that the expression of 尾 -defensin can be enhanced by nutritional factors, thus increasing the resistance of the body to external pathogens, thus reducing the use of antibiotics in livestock and poultry breeding. Whether there is such a regulator in poultry? The intestinal tract has the function of digestion and absorption, but also has immune function. It is an ideal model to study the effect of vitamin D on the expression of 尾 -defensin gene under immune stress. In this study, we optimized the isolation of chicken intestinal epithelial primary cells. The results showed that the intestinal tissue of chicken embryo at 15 days old was more suitable for the isolation and culture of intestinal epithelial cells. The number of intestinal crypt groups was more and the utilization rate of chicken embryo was improved greatly by adopting the digestion strategy of several times and little time. The cell sieve was used to distinguish crypt from single cell so that the time for purification of intestinal epithelial cells was greatly reduced and the purity was higher than 85%. After 24 h-48 h of primary culture of intestinal epithelial cells entered the logarithmic growth phase, the cell line was blurred and apoptosis began to appear. 400,800 渭 g / mL) and vitamin D 00.2g / mL20. The results showed that low concentration of LPS could not induce the immune response of intestinal epithelial cells. LPS at 800 渭 g / mL could significantly increase the expression of IL-1 and IL-6. In other words, 800 渭 g / mL of LPS was selected as the effective concentration to activate the immune response of chicken intestinal epithelial cells. Vitamin D alone had no significant effect on the expression of IL-6 and IL-1 in intestinal epithelial cells, but on the basis of adding LPS, it could significantly increase the expression of VDR. A significant decrease in the expression of IL-I and IL-6 suggests that vitamin D can inhibit the inflammatory response induced by LPS, and this inhibition is enhanced with the increase of vitamin D concentration. The concentration of vitamin D was 20 渭 g / mL. The primary cells of chicken intestinal epithelium were treated with the selected concentration of LPS and VD. The results showed that LPs could significantly increase the concentration of GAL-1 and GAL-3. The expression of GAL-12 and GAL-13 in the GAL-10 of GAL-9 of GAL-4 and GAL-5; Vitamin D could significantly increase the expression of GAL-6 and GAL-9 in GAL-5 of GAL-3, but only under the condition of immune stress. The analysis of the promoter region of 尾 -defensin gene in 14 species of chickens revealed that 7 species contained VDRE loci, 6 of which were regulated by vitamin D. Vitamin D can increase the expression of 尾 -defensin in intestinal epithelial cells under immune stress, and the regulation of vitamin D on 尾 -defensin may be related to the VDRE of its promoter region. But the specific mechanism still needs further verification.
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S831

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