發(fā)布時間：2018-01-10 09:39

  本文關鍵詞：Rln3a在尼羅羅非魚精子發(fā)生過程的作用及分子機制研究　出處：《西南大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：松弛素家族在生殖學領域受到關注,哺乳類RLN3是一種新型的松弛素家族成員,在腦和睪丸中表達。迄今為止,關于RLN3生物學功能的報道,主要作為一種神經(jīng)肽參與腦部的神經(jīng)調節(jié):如應激反應、激勵、主動性、調節(jié)攝食活動等。小鼠的RLN3基因敲除導致其焦躁不安,憂慮多動,因而RLN3長期以來作為一種神經(jīng)肽,治療神經(jīng)疾病,如抑郁癥等。硬骨魚類出現(xiàn)了rln3復制基因:rln3a和rln3b,其中rln3a是脊椎動物中rln3的直系同源基因,本課題組的前期研究基礎表明rln3a在羅非魚腦和精巢中有較高的表達水平,但迄今為止未見關于rln3參與脊椎動物生殖調控的報道。為了揭示rln3a在硬骨魚類精子發(fā)生過程中的作用,本研究以尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)為實驗對象,設計了一系列的實驗進行證明。羅非魚是重要的世界性養(yǎng)殖魚類,它的性別決定類型是XX和XY型,其單性魚苗很容易獲得,我們實驗室已完成對羅非魚性別分化不同發(fā)育時期(孵化后5、30、90、180天)雌雄性腺的轉錄組測序,深入研究了類固醇激素(11-KT和DHP)、生長因子(IGF3和AMH等)、轉錄因子(Dmrt1和Sf1等)對羅非魚精子發(fā)生過程的調控,建立了羅非魚的基因敲除平臺,這些工作使得羅非魚成為研究硬骨魚類育性的良好實驗動物。在本研究中,我們在獲得rln3a突變F0代個體的基礎上,篩選到F1代rln3a的突變個體,深入研究該基因突變影響精巢分化、精子發(fā)生的分子機制。首先通過免疫組化、H.E.染色、流式細胞儀和電鏡等方法研究了rln3a突變對精巢組織結構、精子發(fā)生和育性等過程的影響。其次,分別對rln3a突變個體和對照魚的腦和性腺組織進行轉錄組分析,在腦和性腺中篩選出一系列顯著差異表達基因。最后通過Realtime PCR和免疫組化驗證了rln3a突變前后這些基因在性腺中的表達模式,闡明了rln3a影響羅非魚精子發(fā)生的分子機制。我們得出的研究結果歸納如下:1)對已獲得的F0代rln3a基因突變個體飼養(yǎng)至性成熟,通過F0代突變雄性個體與正常雌性個體受精得到F1代。運用H.E.染色對3月齡F1代rln3a基因突變的羅非魚個體進行組織學觀察,結果發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變個體的性腺中精子發(fā)生啟動延遲,與對照組相比未發(fā)現(xiàn)初級和次級精母細胞等各級生精細胞。免疫組化實驗未檢測到雄激素(Cytochrome P450,family 11,subfamily C,polypeptide 1,11-KT)合成酶(Cyp11b2)的表達。另外,通過抗增殖細胞核抗原(PCNA)染色發(fā)現(xiàn)在rln3a突變的精巢中的表達水平顯著低于對照組的精巢。因此,我們推測rln3a基因的突變影響羅非魚精子發(fā)生的啟動和精原細胞的增殖。2)通過H.E.染色發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變成魚的精巢精小葉紊亂,幾乎未見精子細胞和成熟精子。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變個體的精巢出現(xiàn)空腔,精巢的橫切面積和精子數(shù)量顯著低于對照組。通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)在rln3a基因突變魚的性腺中未發(fā)現(xiàn)成熟精子,但與對照組個體相比,rln3a基因突變魚未影響精巢中精母細胞的分化。3)通過F1代rln3a基因突變成魚與正常XX個體受精實驗發(fā)現(xiàn),胚胎到受精后2天(囊胚期)幾乎全部死亡,表明rln3a基因突變個體不能正常受精。分別取rln3a基因突變魚和正常羅非魚的精液,用流式細胞儀和電腦輔助的精子分析儀進行相應的測定,發(fā)現(xiàn)rln3a基因突變個體的精子體積(FSC)和細胞內復雜程度(SSC)顯著低于對照組。精子活力測定結果顯示,rln3a基因突變個體的精子活力相關參數(shù)(平均直線、曲線運動速度、精子活力、精子濃度)顯著低于對照組。通過對血清中激素水平的測定發(fā)現(xiàn),rln3a基因突變個體血清中11-KT、FSH和LH的水平顯著低于對照組XY個體。4)為了進一步研究rln3a基因突變對羅非魚個體的影響,我們分別對rln3a基因突變和對照組個體的腦和性腺進行轉錄組測序。在腦和性腺中篩選出rln3a基因突變前后顯著差異表達的基因,并且對這些差異表達基因進行GO和KEGG的分析。最后通過Real-time PCR驗證了這些基因在rln3a基因突變前后性腺中的表達模式,進而闡明了rln3a突變影響羅非魚的精子發(fā)生和育性過程的分子機制。綜上所述,本研究通過基因敲除和轉錄組技術,系統(tǒng)研究了rln3a突變對羅非魚精巢分化、精子發(fā)生啟動、精子發(fā)生過程和雄性育性等過程的影響,闡明了基因突變影響精巢分化、精子發(fā)生的功能和分子機制。
[Abstract]:In order to reveal the role of rln3a in human brain and testis , a series of experiments have been carried out in order to reveal the role of rln3a in human brain and testis . In order to reveal the role of rln3a in the process of spermary genesis of tilapia , it has been shown that rln3a has a high level of expression of rln3 in the brain and testis of tilapia . In order to further study the effect of rln3a gene mutation on the sperm motility related parameters ( average straight line , curve movement speed , sperm motility and sperm concentration ) of rln3a gene mutation , we found that rln3a gene mutation had a significant difference in sperm motility related parameters ( average line , curve movement speed , sperm motility , sperm concentration ) .

【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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1 劉宏建,董明敏,婁衛(wèi)華;神經(jīng)端側吻合術治療聲帶麻痹的實驗研究[J];臨床耳鼻咽喉科雜志;2003年09期

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本文編號：1404788