本文關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病病毒gE蛋白的表達(dá)及間接ELISA的建立

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【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies, PR)的病原為偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV),屬于甲皰疹病毒亞科,能感染除短尾猿以外的大多數(shù)哺乳動物,對貓、牛、羊、馬等有致死性。PR是豬群中重要的直接或間接接觸性傳染病,豬是PRV病毒的唯一自然中間宿主,攜帶此病毒的豬可終身排毒,使得PR快速暴發(fā),并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。PRV基因組全長約150 kb, GC含量高達(dá)74%,可編碼70種以上病毒蛋白。其中,糖蛋白E(gE)作為PRV的重要毒力而非必需糖蛋白,對PRV感染神經(jīng)組織起著決定性的作用,將gE基因從病毒全基因組中敲除,可得到經(jīng)過弱化的基因缺失疫苗。在我國,感染PRV的豬場主要表現(xiàn)為豬群gE抗體的陽性率顯著升高,母豬產(chǎn)下弱仔、死胎,并且仔豬出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀及死亡等情況；暴發(fā)疫情的養(yǎng)豬場接種了PRV gE基因缺失疫苗后,在死亡的仔豬以及流產(chǎn)胎兒的身上仍能分離到PRV野毒株,且存在gE基因的變異。說明僅接種gE基因缺失疫苗,而不配合使用gE蛋白的抗體診斷技術(shù)是無法有效控制PR疾病的。gE在所有野毒株中都有表達(dá),可作為區(qū)分疫苗株與野毒株感染的標(biāo)記蛋白。因此,建立快速高效的gE-ELISA診斷方法是非常必要的。目前,臨床上我國主要使用昂貴的進(jìn)口gE-ELISA試劑盒,不利于大面積推廣。為建立一種適合我國的敏感、特異的豬偽狂犬病毒野毒抗體血清學(xué)檢測方法,本研究通過對河南南陽豬場分離的PRV野毒株HNNYV1進(jìn)行主要抗原表位區(qū)gE基因的克隆,PCR擴(kuò)增了長約318 bp的gE片段,將此gE片段克隆至pET28a(+)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化BL21菌株,經(jīng)37℃、220 rpm、0.5 mM IPTG誘導(dǎo)8h獲得重組gE蛋白的最大量表達(dá)。因重組蛋白具有His標(biāo)簽,經(jīng)親和層析柱純化后,獲得了高純度的gE蛋白。通過免疫印跡檢測證明具有良好的抗原性和特異性。同時,以純化蛋白為包被抗原,經(jīng)間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了檢測偽狂犬病毒野毒抗體的間接gE-ELISA方法。具體如下：以純化的gE蛋白做包被抗原,包被量為0.5 μg/mL,4%明膠37℃封閉2 h,待檢血清1：100稀釋、37℃孵育1.5h,酶標(biāo)抗體1：40000稀釋、37℃孵育1h, TMB顯色10 min,測OD450nm,大于0.463判為陽性,小于0.402判為陰性,介于兩者之間判定為可疑,可重復(fù)實(shí)驗(yàn)判定。該方法與豬圓環(huán)病毒(PCV)、藍(lán)耳病(PRRSV)、PRV gB基本無交叉反應(yīng),批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)較小,顯示重復(fù)性良好。該方法與IDEXX gE-ELISA抗體檢測試劑盒的符合率為91.67%。本研究建立的間接gE-ELISA檢測方法為PRV野毒抗體檢測以及野毒感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了一種新的血清學(xué)檢測方法。
【學(xué)位授予單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

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本文編號：1296839