發(fā)布時間：2017-12-16 16:34

  本文關(guān)鍵詞：基于RT-LAMP的口蹄疫病毒（FMDV）通用型快速檢測方法構(gòu)建

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【摘要】：口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)引起的一種動物傳染性疫病,主要侵染偶蹄類動物,以豬,牛,羊易感,偶見于人和其他動物。FMD致死率較高,幼年個體死亡率高達(dá)100%,感染后常不見癥狀而猝死,成年個體死亡率較低。目前,FMD對畜牧養(yǎng)殖業(yè)及人類健康構(gòu)成巨大威脅,是世界動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties,OIE)法定報告的動物傳染病之一。FMDV為RNA病毒,變異較快,給疫苗研制帶來巨大困難。病原學(xué)檢測,血清學(xué)檢測,分子生物檢測等是常見的傳統(tǒng)檢測方法,但技術(shù)要求高,檢測周期長,在基層單位檢測及現(xiàn)場快速檢測中應(yīng)用受限。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(reverse transcription loop mediacted isothermal amplification,RT-LAMP)是一種新技術(shù),該技術(shù)操作簡單,反應(yīng)快速,僅需一個水浴鍋,在一個小時內(nèi)就可以完成核酸的檢測。據(jù)此原理,本研究探索并建立了FMDV通用型RT-LAMP快速檢測方法。主要研究結(jié)果如下:1)引物設(shè)計:對O型,A型及亞洲Ⅰ型3種血清型FMDV全基因組序列進(jìn)行比對,利用LAMP引物在線設(shè)計軟件primer explorer V5,設(shè)計40套RT-LAMP引物,根據(jù)LAMP評分原則等方法篩選出3套特異性引物,初步建立了FMD通用型RT-LAMP檢測方法。2)方法優(yōu)化:為提高RT-LAMP檢測效率,對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,最終確立的25μL的RT-LAMP最佳反應(yīng)體系為:外引物(F3/B3)各12 m M,內(nèi)引物(FIP/BIP)各40 m M,環(huán)引物(LF/LB)各35 m M,鎂離子的濃度8 m M,甜菜堿的濃度為0.24 M,d NTP的濃度1.8 m M,Bst DNA大片段聚合酶濃度6.4U/μL,AMV反轉(zhuǎn)錄酶的濃度為0.16 U/μL,10×Bst DNA大片段聚合酶Buffer添加量2.5μL,染料添加量1μL,模板添加量2μL并用無菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)程序為:63℃,60 min;80℃,10 min。3)敏感性檢測:利用中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所(簡稱蘭獸研)提供的7種FMD代表毒株作為RT-LAMP敏感性檢測方法的模板,同時利用蘭獸研的FMD熒光檢測試劑盒作對比,本研究的ΔRn值高于蘭獸研檢測ΔRn值,RT-LAMP檢測方法敏感性高于蘭獸研FMD熒光檢測試劑盒敏感性。并且本研究方法對于目前國內(nèi)常見的O型FMDV毒株Mya-98和Pan Asia,及A型毒株Sea-97 G2的敏感性較好。4)靈敏度檢測:本研究所建立的檢測方法能夠同時檢測出三種血清型FMDV,對O型的檢測靈敏度最高。分別以10倍梯度稀釋的O型,A型及亞洲Ⅰ型3種血清型FMDV核酸作模板,進(jìn)行靈敏度檢測,其檢測下限分別是10-6,10-4和10-2。通過與OIE RT-q PCR檢測方法、蘭獸研FMDV檢測試劑盒和中國動物疫病預(yù)防控制中心(簡稱疫控中心)RT-PCR方法作對比,O型檢測靈敏度高于OIE RT-q PCR檢測方法3個數(shù)量級,高于蘭獸研FMDV檢測試劑盒2個數(shù)量級,與疫控中心RT-PCR法接近;A型檢測靈敏度高于OIE RT-q PCR檢測方法和疫控中心RT-PCR法2個數(shù)量級,與蘭獸研FMDV檢測試劑盒接近;亞洲Ⅰ型檢測靈敏度稍低于其它檢測方法。5)特異性檢測:本方法特異性強(qiáng),分別以O(shè)型,A型和亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸、豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、豬圓環(huán)病毒(porci ne circovirus,PCV)、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)、豬偽狂犬病毒(p orcine pseudorabies virus,PRV)、豬藍(lán)耳病毒(porcine reproductive and respir atory syndrome virus,PRRSV)、副豬嗜血桿菌(haemophilus parasuis,Hps)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)核酸作本研究特異性檢測的模板,O型,A型和亞洲Ⅰ型的FMDV的反應(yīng)液顯示為陽性天藍(lán)色,非FMD病毒反應(yīng)液為陰性淡紫色。本研究建立了一種FMDV通用型RT-LAMP快速檢測方法。該方法的敏感性好,靈敏度高,特異性強(qiáng),適合于目前國內(nèi)多發(fā)的FMDV類型的檢測。對于現(xiàn)場FMDV的快速檢測具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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