本文關(guān)鍵詞：GhCOI1和GhMYC2基因?qū)γ藁S萎病抗性的VIGS分析

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【摘要】：為了對抗生物或非生物逆境脅迫,植物在漫長的進(jìn)化中獲得了相應(yīng)的生理機(jī)能來行使應(yīng)答或防御功能。作為一類非常重要的自身代謝物,植物激素在其生長發(fā)育過程中的作用是其它種類化合物無法直接替代的。茉莉酸(Jasmonate acid,JA)及其衍生物質(zhì)能直接誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng),調(diào)控許多相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的來行使各種生理功能。人們對于茉莉素類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程已有了初步了解,發(fā)現(xiàn)了許多調(diào)控效應(yīng)基因和關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子,目前為止對其都已經(jīng)有了較多報道與研究,但是在農(nóng)作物,尤其在棉花等經(jīng)濟(jì)作物中的研究尚需進(jìn)一步深入。植物中冠菌素不敏感因子(Coronatine-insensitive 1,COI1)是茉莉酸(Jasmonate,JA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子。在擬南芥中,COI1缺失突變體表現(xiàn)為對各種茉莉酸應(yīng)答反應(yīng)不敏感或者不響應(yīng),在受到病原菌侵染時不能及時反饋信號分子,無法使得相應(yīng)應(yīng)答反應(yīng)基因表達(dá)。研究表明,植物中髓細(xì)胞組織增生蛋白(Myelocytomatosis proteins,MYCs)是茉莉酸類激素響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子,并廣泛的存在于動植物中。MYC2轉(zhuǎn)錄因子屬于植物螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族(basic helix-loop-helix protein,bHLH),它對JA信號的傳遞起著非常重要的作用。病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是指病毒載體侵染植物后,能夠誘導(dǎo)當(dāng)代植物發(fā)生內(nèi)源性基因沉默而出現(xiàn)表型變化的一種研究基因功能的技術(shù)。我們通過生物信息學(xué)分析克隆出棉花中的COI1基因和MYC2相關(guān)基因,通過上述VIGS方法沉默陸地棉中GhCOI1和GhMYC2這兩個基因,分析其對V991的抗病反應(yīng),確定它們在棉花中的抗病性,為棉花在抗病育種方面的研究提供實驗數(shù)據(jù)分析,同時為深入理解植物響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制做出初步研究。取得的研究結(jié)果如下:1.通過NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析,電子克隆棉花相關(guān)的COI1和MYC2基因全長序列。用DNAMAN軟件設(shè)計引物,以棉花基因組cDNA為模版擴(kuò)增出目的基因全長,經(jīng)酶切和測序鑒定,克隆GhCOI1與GhMYC2兩個基因。2.我們對GhCOI1與GhMYC2兩個基因表達(dá)的組織特異性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示兩個基因均在根中優(yōu)勢表達(dá)。對試驗棉花接種V991后,結(jié)果顯示GhCOI1與GhMYC2基因表達(dá)受到大麗輪枝菌侵染的誘導(dǎo);GhCOI1在接種病菌12h后表達(dá)量最高,GhMYC2在接種3h后表達(dá)最高,隨著時間的增加這兩個基因表達(dá)量有所下降,但總體來說呈現(xiàn)上升趨勢。3.針對目標(biāo)序列通過Primer5.0軟件設(shè)計特異引物,擴(kuò)增得到沉默靶基因序列后再將該序列插入到病毒載體pYL-156上。經(jīng)酶切和測序鑒定后,得到重組載體pYL-156-GhCOI1和pYL-156-GhMYC2。利用電擊法將上述重組載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中,得到VIGS工程菌。在未長出真葉的棉花幼苗子葉上接種制備好的VIGS工程菌,獲得沉默植株。4.待參照基因PDS出現(xiàn)葉漂白表型(白斑或完全失綠)后,提取對照植株和目的基因沉默植株的總RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈后進(jìn)行RT-PCR和qPCR檢測。結(jié)果表明,沉默植株目標(biāo)基因的表達(dá)均被抑制,基因沉默效果在85%以上。5.對上述GhCOI1和GhMYC2沉默植株分別接種致病菌V991,結(jié)果指出這兩個基因沉默植株對大麗輪枝菌的耐受性減弱,表型顯示它們更容易感染病菌,而對照植株對大麗輪枝菌有明顯的耐病性。這些結(jié)果闡明了兩個目的基因直接參與了棉花對大麗輪枝菌的抗性反應(yīng),而且GhCOI1和GhMYC2正調(diào)控棉花的抗病性。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S435.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1286315