本文關(guān)鍵詞：綿羊肺腺瘤病PCR檢測技術(shù)的建立及exJSRV與enJSRV載量相關(guān)性分析

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【摘要】：綿羊肺腺瘤病(OPA)的病原是綿羊肺腺瘤病毒(JSRV),是一種可傳播的綿羊肺腫瘤疾病。OPA自19世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)以來,至今也沒可靠的方法控制其傳播,并且影響著很多國家養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。該病有一個重要特點就是在OPA病羊血液中未曾檢測到循環(huán)抗體,所以不能用常規(guī)的血清學(xué)方法進行診斷。為了建立針對該病靈敏度高、特異性好的檢測方法,以及探究外源性綿羊肺腺瘤病毒(exJSRV)和內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的相對表達(dá)量是否存在相關(guān)性,本研究建立了巢式RT-PCR和exJSRV Taqman實時熒光定量PCR檢測方法,針對OPA的早期、快速檢測。根據(jù)GenBank上發(fā)表的exJSRV基因序列(登錄號JQ837489.1與AF105220.1)設(shè)計合成巢式RT-PCR、Taqman實時熒光定量PCR引物及擴增exJSRV-env全基因的引物。利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法對檢測樣品進行分析,比對各樣品中exJSRV與enJSRV的載量關(guān)系。對兩種方法檢測出的陽性血樣的羊只進行跟蹤試驗,進行組織病理學(xué)驗證。巢式RT-PCR、Taqman實時熒光定量PCR方法分別可檢測到9.72 fg的病毒RNA和為10-1 copies的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。特異性試驗結(jié)果表明兩種方法僅可特異性的擴增exJSRV。臨床檢測陽性的部分樣品(1份鼻液和2份血樣)經(jīng)送檢測序,序列比對結(jié)果顯示鼻液、血樣的巢式外套與內(nèi)套RT-PCR擴增產(chǎn)物與JQ837489.1同源性均高達(dá)98.9%以上,且擴增基因序列翻譯的氨基酸序列中具有外源性綿羊肺腺瘤病毒特有的致病性"YXXM"序列。所建立的qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)與模板濃度呈良好的線性關(guān)系。同時分析比較同一樣品中exJSRV與enJSRV相對表達(dá)量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)在自然感染病肺中、本實驗室長期跟蹤羊只的肺組織及疑似OPA羊只的鼻液中,exJSRV都較enJSRV有高表達(dá)量,而血樣中正好相反,這正好解釋了對各樣品進行exJSRV-env全基因的擴增,病肺與鼻液的擴增產(chǎn)物與exJSRV具有高同源性;血樣的擴增產(chǎn)物與enJSRV同源性高。本試驗所建立的方法,具有良好的臨床應(yīng)用價值且靈敏性高、特異性好,這對OPA的早期檢測提供了一種方便、可靠、經(jīng)濟實用的診斷方法,并且為定量分析exJSRV感染程度奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.26

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