發(fā)布時(shí)間：2017-12-11 23:29

  本文關(guān)鍵詞：BRSV G蛋白單克隆抗體的制備及其DAS-ELISA方法的建立

  更多相關(guān)文章： 牛呼吸道合胞體病毒 G蛋白 多克隆抗體 單克隆抗體 雙抗體夾心ELISA

【摘要】：為建立檢測(cè)牛呼吸道合胞體病毒DAS-ELISA方法,根據(jù)BRSV外膜糖蛋白G保守基因設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建重組克隆載體和重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),應(yīng)用純化的G蛋白作為抗原分別免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠制備抗G蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體,利用單克隆抗體的高特異性及雙抗體夾心的靈敏性建立檢測(cè)BRSV的DAS-ELISA方法。G目的基因同GenbankTM(U24713)上發(fā)表的牛呼吸道合胞體病毒G基因核苷酸序列同源性為99.83%,氨基酸同源性為99.48%,目的蛋白為可溶性蛋白,大小為36 kDa,表達(dá)的G蛋白與BRSV抗體能很好地結(jié)合,具有良好的反應(yīng)原性。重組BRSV-G/E.coli在IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為1 mM且誘導(dǎo)5 h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高,洗脫液中咪唑濃度為200 mM時(shí)純化效率最高,純化后蛋白濃度為1.5 mg/mL左右。免疫動(dòng)物后,獲得了兔高免血清和5株能夠穩(wěn)定分泌抗G蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1E3、2B4、3F6、4B8、5F7,抗體亞類均為IgG1型,輕鏈均為κ鏈,雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體效價(jià)分別為1∶2560、1∶640、1∶12800、1∶320、1∶640,腹水效價(jià)分別為1∶256000、1∶128000、1∶128000、1∶64000、1∶128000,以抗體效價(jià)較高且穩(wěn)定性最好的1E3作為捕獲抗體,多克隆抗體為檢測(cè)抗體,方陣滴定試驗(yàn)確定捕獲抗體1E3最佳工作濃度為2.5μg/mL,多克隆抗體最佳工作濃度為5μg/mL,并對(duì)其他反應(yīng)條件作了進(jìn)一步的優(yōu)化,陰陽性臨界值為0.239,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%,檢測(cè)下限為1.43μg/mL,用建立的DAS-ELISA檢測(cè)方法分別檢測(cè)常引起牛呼吸道疾病的幾種病原,只有牛呼吸道合胞體病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。DAS-ELISA和RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)45份樣品,敏感性、特異性、符合率分別92.0%、100%、95.6%。結(jié)果表明建立的DAS-ELISA檢測(cè)方法快速、靈敏度高、特異性強(qiáng),適用于臨床樣品大規(guī)模的檢測(cè),為BRSV疫情的監(jiān)測(cè)和快速診斷奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李艷婷;BRSV G蛋白單克隆抗體的制備及其DAS-ELISA方法的建立[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2017年

，

本文編號(hào)：1280364